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TIM3、PD-1及B7-H3在恶性血液病中的表达和临床意义

研究背景及目的:恶性血液肿瘤是一类源于造血系统的恶性克隆性疾病,其病因及发病机制复杂,恶性程度高、治疗难度大、患者生存期短,预后差,易复发及耐药形成是当今面临的难题,负性共刺激分子如TIM3、PD-1、B7-H3等在疾病的发生发展中有着重要意义,通过负性调节信号抑制机体免疫系统的免疫应答,使免疫活性降低,导致免疫逃逸发生,促使肿瘤发生发展。本研究主要通过流式细胞术检测血液恶性肿瘤患者T淋巴细胞亚群及其表面的TIM3、PD-1和原始细胞的B7-H3的表达水平,并分析其表达水平和疾病状态、临床特征、预后之间的关系,进一步探讨其在疾病发生中的作用及对疾病预后,为靶向免疫治疗恶性血液肿瘤提供理论基础。方法:(1)病例收集:选取2022年6月-2023年1月就诊于西南医科大学附属医院血液内科确诊为血液恶性肿瘤患者共88例,包括54例初诊患者,13例复发难治患者,21例完全缓解患者,收集研究对象抗凝骨髓、外周血、病历资料及患者的临床疗效,另收集22例缺铁性贫血患者外周血作为对照组。(2)采用流式细胞术测定血液系统恶性肿瘤患者骨髓T细胞亚群及表面PD-1、TIM3的表达水平,和B7-H3在原始细胞上的表达情况。(3)检测治疗前后患者外周血中细胞因子水平,分析患者免疫状态变化。(4)分析T细胞亚群及其表面的TIM3、PD-1和原始细胞的B7-H3的表达水平,并分析其表达和疾病状态、临床特征、预后之间的关系。(5)利用Excel 2007软件进行数据整理,数据分析使用SPSS 22.0软件,资料服从正态分布,用t检验,否则,使用Wilcoxon秩和检验,通过X~2检验比较组间数据,P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果:(1)血液系统恶性肿瘤患者总人数88人,男性50例www.selleck.cn/products/repsox(57%),ZD1839临床试验女性38例(43%),发病中位年龄56(14-92)岁,髓系肿瘤患者53人(60%),包括急性髓系白血病(AML)42例,骨髓增生异常综合征(MDS)9例,原发性骨髓纤维化(PMF)2例;淋系肿瘤患者35人(40%),包括淋巴瘤(Lymphoma)18例,急性淋巴细胞白血病(ALL)13例,多发性骨髓瘤(MM)3例,慢性淋巴细胞白血病(CLL)1例。(2)采用流式细胞术检测血液系统恶性肿瘤患者的骨髓T淋巴细胞上PD-1、TIM3表达情况及原始细胞的B7H3表达情况,结果显示初诊、完全缓解和未缓解组骨髓中CD4+PD1+T、CD4+TIM3+T、CD8+TIM3+T、CD8+PD1+T表达均高于对照组(P均<0.05),未缓解组和初诊组TIM3、PD1表达水平均高于完全缓解组(P均<0.05);髓系肿瘤组及淋系肿瘤组的骨髓T淋巴细胞亚群上PD-1、TIM3均高于对照组;以原始细胞上B7H3的中位表达水平5.22%为临界值,高于此水平为高表达组,否则为低表达组,初诊组高表达8例(80%),低表达2例(20%);完全缓解组高表达3例(21%),低表达11例(79%);未缓解组高表达2例(67%),低表达1例(33%),初诊组及未缓解组B7H3高表达率高于完全缓解组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)采用流式细胞学检测血液系统恶性肿瘤患者的骨髓中T细胞亚群及其比值,初诊组、完全缓解组、未缓解组的CD4+T淋巴细胞水平均低于对照组(P均<0.05);初诊组(P<0.05)、未缓解组(P<0.05)和缓解组(P>0.05)的CD8+T淋巴细胞水平均高于对照组,初诊组、未缓解组和完全缓解组的CD4+T/CD8+T比值均低于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。(4)检测患者治疗前与治疗后的外周血细胞因子,分析患者免疫状态变化,治疗后患者IL-2、γ-干扰素水平升高,IL-4、IL-6、IL-10、α-肿瘤坏死因子水平减低(P均<0.05),提示th1/th2亚群以th1反应为主,免疫功能部分恢复,抗肿瘤效应增强。结论:(1)PD-1、TIM3及B7H3在血液系统恶性肿瘤中存在共表达,各疾病之间无明显差异,表达水平与疾病状态及预后相关,高表达提示预medical overuse后不良,PD-1、TIM3表达水平存在正相关性,各种免疫抑制分子之间存在协同表达,高表达代表免疫抑制状态,提示可能参与恶性血液病发病和复发,参与肿瘤细胞免疫逃逸,促进疾病发生发展。(2)患者T淋巴细胞亚群CD4+T/CD8+T的比率升高表明免疫功能恢复,抗肿瘤效应增强,比值的降低表明免疫功能受抑;经治疗后患者IL-2、γ-干扰素水平呈升高趋势,IL-4、IL-6、IL-10、α-肿瘤坏死因子水平呈降低趋势,th1/th2亚群以th1反应为主,提示免疫功能部分恢复,抗肿瘤效应增强,T淋巴细胞及细胞因子对于维持免疫反应平衡和加强抗肿瘤效应至关重要。

RETREG1介导内质网自噬对脓毒症时树突状细胞坏死性凋亡的保护效应及机制研究

研究背景和目的脓毒症(Sepsis)是指宿主对于感染反应失调所致危及生命的器官功能障碍,其作为一个全球性重大健康问题,对医疗卫生和社会进步造成了极大负担。脓毒症的发病机制及病理生理学过程非常复杂,近年来的资料提示机体免疫功能紊乱参与了脓毒症发生发展的全过程,且严重持续性免疫抑制状态可诱发多种致死性并发症,使脓毒症患者中晚期死亡率显著升高。脓毒症时机体免疫应答障碍的重要特征是多种天然及获得性免疫细胞数量的锐减和功能异常。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一类在天然免疫和获得性免疫应答中起关键桥梁作用的专职抗原提呈细胞,其被证实在脓毒症、多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重并发症免疫失调网络中发挥核心作用。脓毒症状态下,DC表现为数量大幅减少及功能障碍,且与患者病情严重程度、不良预后及死亡率升高息息相关。据报道,DC可同时发生多种细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)模式,包括凋亡、焦亡及铁死亡等,是脓毒症时DC数目缺如的主要原因之一。坏死性凋亡(Necroptosis)作为一种重要的依赖于受体相互作用蛋白激酶(Receptor interacting protein kinase,RIPK)1/3的炎性死亡方式,可导致大量促炎因子及损伤相关分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMPs)的产生和释放,并形成恶性循环,进一步加剧脓毒症过程中免疫功能障碍和组织器官损伤。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)作为真核细胞内最大的膜性细胞器,是多种细胞活动的中心。脓毒症状态下,不同刺激因素均可引发新合成及错误折叠蛋白质异常增多,并最终造成内质网稳态失衡及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),从而激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。作为缓解细胞ERS的重要内源性保护机制,内质网选择性自噬(Reticulophagy/ER-phagy)在细胞内稳态维持中发挥关键调节效应,对多种人类疾病的发生发展产生重要影响。许多资料表明,ERS与ER-phagy的有效联动是内质网质量控制的核心机制之一。网织吞噬调节器1(Reticulophagy regulator 1,RETREG1)是哺乳动物细胞内第一个被证实ER-phagy的特异性受体,其介导的ER-phagy对细胞在应激条件下维持内质网稳态和细胞存活至关重要。业已明确,当多种因素导致ER-phagy发生功能及活化障碍时,ERS及内质网稳态得不到及时恢复,将最终引起细胞死亡通路的激活。由于目前对于ER-phagy的研究相对较少,其与ERS联动的关键环节及调控PCD的确切机制亟待阐明。鉴于此,本研究以RETREG1介导ER-phagy对DC坏死性凋亡的可能影响与调控途径为切入点,深入探究脓毒症免疫抑制的分子机制并寻找潜在免疫调控靶点,旨在为脓毒症及MODS的防治提供新思路和新策略。实验方法第一部分:1.体内实验采用野生型(Wild-type,WT)雄性C57BL/6J小鼠,构建盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)所致脓毒症模型,分别于CLP术后12、24及72小时(h)采用CD11c~+磁珠分离提纯脾脏DC,采用流式细胞术检测DC坏死性凋亡率的改变情况;采用蛋白印迹(Western blot,WB)方法检测CLP术后不同时间点坏死性凋亡相关蛋白[RIPK1、RIPK3、伪激酶混合家族激酶样域(Pseudokinase mixed family kinase-like domain,MLKL)]磷酸化水平变化。体外诱导坏死性凋亡时,采用1μg/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)或1μg/ml LPS联合20μM Z-VAD-FMK[z VAD,一种广谱胱天蛋白酶(Caspase,CASP)抑制剂,用于诱导坏死性凋亡]刺激WT小鼠脾脏DC 24 h后,采用流式细胞术检测各组DC坏死性凋亡率;应用STYOX Green染色检测DC坏死细胞占比;采用WB方法检测磷酸化RIPK1、RIPK3及MLKL相对蛋白表达水平;采用激光共聚焦显微镜观察磷酸化(p)-MLKL及p-RIPK3水平及阳性细胞数量;通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析各组培养上清液中DAMPs及炎性细胞因子释放情况,包括白细胞介素(Interleukin,IL)-1α、IL-33、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMBG1)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)等。2.采用Necrostatin-1(Nec-1,一种特异性RIPK1抑制剂)于CLP术后按1.65 mg/kg剂量对脓毒症小鼠腹腔注射给药,采用流式细胞术及WB方法检测Nec-1对DC坏死性凋亡的影响,并观察给药后脓毒症小鼠7天(d)生存率的差异。体外实验中,在20μM Nec-1预处理DC 30分钟(min)后给予LPS+z VAD联合刺激细胞24 h,采用流式细胞术、STYOX Green染色、WB、激光共聚焦显微镜及ELISA检测Nec-1在体外对DC坏死性凋亡的作用。3.体内实验采用WT雄性小鼠复制CLP模型,术后24及72 h分离提纯脾脏DC,采用流式细胞术分析DC表面功能分子[包括CD80、CD86、主要组织相容复合体(Major histocompatibility complex,MHC)-II]表达水平;进一步将DC与WT小鼠脾脏CD4~+T细胞按1:20进行共培养实验,采用CCK-8及ELISA方法分别检测T细胞增殖活性和上清液中细胞因子[IL-2、IL-4及干扰素(Interferon,IFN)-γ]分泌水平,以评估CD4~+T细胞分化方向。采用流式细胞术分析CLP术后外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中CD3~+T、CD4~+T细胞以及CD4~+FOXP3~+调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)占比的变化规律;应用ELISA检测脓毒症后不同时间点外周血中IL-2、IL-4、IL-10、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)-β及IFN-γ分泌水平。4.在体外培养WT小鼠脾脏DC时,采用1μg/ml LPS或1μg/ml LPS+20μM z VAD刺激细胞24 h后,应用流式细胞术及共培养实验分析各组DC免疫功能改变情况。5.体内实验中,CLP术后24 h及72 h收集WT小鼠脾脏DC,采用WB方法检测ER-phagy相关蛋白[RETREG1、SEC61B(SEC61translocon subunitβ)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3B)]表达情况;利用激光共聚焦显微镜观察各组DC中ER分别与自噬小体及溶酶体的共定位强度;通过透射电子显微镜观察CLP术后不同时间点DC内质网形态、自噬体数量及含内质网结构自噬体数目的变化规律。体外实验中,分离WT小鼠脾脏DC并给予1μg/ml LPS刺激,24 h及72 h后收集细胞,采用WB、激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜比较LPS处理不同时间点RETREG1介导ER-phagy活性变化情况。第二部分:1.利用WT及Retreg1基因缺陷(Retreg1~(-/-))小鼠,给予细胞1μg/ml LPS体外刺激24 h,通过流式细胞术分析各组DC细胞凋亡率;采用WB方法比较LPS刺激下凋亡/抗凋亡相关蛋白包括CASP3、BCL2关联X蛋白多克隆抗体(BCL2associated X,apoptosis regulator,BAX)、BCL2(BCL2 apoptosis regulator)表达水平的差异。同时,收集LPS刺激24 h后DC[给予20μM尼日利亚菌素(Nigericin,Nig,一种ATP类似物用于激活炎性小体)预处理细胞30 min],采用流式细胞术分析各组DC焦亡率;应用WB方法检测炎性小体及细胞焦亡相关蛋白[CASP1、Gasdermin D(GSDMD)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、含有CARD招募结构域的凋亡相关斑点蛋白(Apoptosis speck-like protein containing a caspase recruiment domain,ASC)]表达水平;通过ELISA检测培养上清液中IL-1β及IL-18含量。2.在体外实验中,分离WT及Retreg1~(-/-)小鼠脾脏DC,给予1μg/ml LPS+20μM z VAD刺激细胞24 h,采用流式细胞术、STYOX Green染色、WB、激光共聚焦显微镜及ELISA等手段检测Reterg1基因缺陷对DC坏死性凋亡的影响。在体内实验中,对WT及Retreg1~(-/-)小鼠行CLP手术,术后24 h分离提取脾脏DC,采用流式细胞术及WB方法分别检测DC坏死性凋亡率及坏死性凋亡相关蛋白表达水平。此外,采用苏木素伊红(Hematoxylin eosin,HE)染色评估小鼠器官(心、肝、肺、肾)病理形态学改变;观察CLP术后7 d各组小鼠生存情况。3.体外培养WT及Retreg1~(-/-)小鼠DC时采用20μM Nec-1预处理后给予细胞LPS+z VAD联合刺激24 h,通过流式细胞术、STYOX Green染色、WB及激光共聚焦显微镜分析抑制坏死性凋亡对脓毒症状态下Reterg1基因缺陷引发DC坏死性凋亡增强的影响。4.构建DC条件性敲除Retreg1基因(Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl))小鼠及其对照组(Retreg1~(fl/fl))小鼠,采用CLP复制脓毒症动物模型,术后24 h分离脾脏DC并采用流式细胞术分析DC表面分子水平;与CD4~+T细胞共培养后,通过CCK-8及CFSE染色法检测各组T细胞增殖活性的差异;应用ELISA检测培养上清液中细胞因子分泌水平。此外,采用流式细胞术比较脓毒症小鼠PBMCs中T细胞亚群占比,通过ELISA分析血清中细胞因子水平;并观察各组小鼠7 d生存情况。5.CLP术后对Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)脓毒症小鼠按1.65mg/kg剂量腹腔注射Nec-1,分离脾脏DC并采用流式细胞术分析各组DC表面功能分子表达水平;通过流式细胞术及ELISA观察对脓毒症小鼠外周免疫抑制状态的影响,并比较各组小鼠CLP术后7 d存活率改变。第三部分:1.在体外培养中采用1μg/ml LPS刺激WT小鼠脾脏DC,于24 h及72 h收集细胞并采用WB方法检测UPR三条通路蛋白表达的变化规律,包括70 k Da热休克蛋白5(Heat shock 70 k Da protein 5,HSPA5)、真核翻译起始因子2α激酶3(Eukaryotic translation initiation factor 2αkinase 3,EIF2AK3)、真核翻译启动因子2A(Eukaryotic translation initiation factor 2A,EIF2A)、转录激活因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)、DNA损伤可诱导转录因子3(DNA Damage inducible transcript 3,DDIT3)、内质网核心信号1(Endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1,ERN1)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)及转录激活因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)等。2.分离WT小鼠脾脏DC,在1μg/ml LPS刺激24 h条件下分别给予三条UPR通路抑制剂(20μM Salubrinal、10μM 4μ8C、100μM AEBSF)对DC进行预处理,采用WB方法比较各组RETREG1及SEC61B蛋白表达水平差异;通过实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,RT-q PCR)检测各组DC中Retreg1 m RNA水平。3.采用1μg/ml LPS体外刺激WT及Atf6基因敲除小鼠(Atf6~(-/-)),分离脾脏DC后通过WB、激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜分析RETREG1介导ER-phagy活性的差异。4.构建Retreg1启动子及Atf6基因质粒并转染入工具细胞HEK293T,采用双荧光素酶报告基因检测ATF6与Retreg1启动子序列的结合情况;通过突变Retreg1启动子序列三处预测结合位点并构建突变体质粒,进一步应用双荧光素酶报告基因探究ATF6与Retreg1基因结合的位点。分离WT小鼠脾脏DC后给予1μg/ml LPS刺激24 h,采用CUT&Tag技术对ATF6结合DNA区域进行测序分析,比对基因组上的测序序列(Reads)在基因区域的分布;对Reads显著富集的区域(Peak)所覆盖基因功能性区域分布进行统计;对Peak邻近基因进行注释探究ATF6可能调控的下游基因,并应用KEGG通路富集分析对这些基因进行深入解析;采用基因组浏览器(Integrative genomics viewer,IGV)可视化分析了解Retreg1基因上游启动序列中是否存在ATF6的结合峰及其位点。5.分离WT小鼠脾脏DC,1μg/ml LPS刺激后给予1μM雷帕霉素(Rapamycin,ULK1激动剂)或5μM GW406108X(ULK1抑制剂)处理调控ULK1活性,通过WB检测UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)与苄氯素1(Beclin 1,BECN1)的磷酸化状态以及ER-phagy相关蛋白表达水平;采用激光共聚焦显微镜观察DC中BECN1与内质网的共定位情况。给予1μg/ml LPS体外处理WT及Becn1基因敲除(Becn1~(+/-))小鼠脾脏DC,通过WB方法检测RETREG1及SEC61B蛋白表达水平;利用激光共聚焦显微镜观察DC中溶酶体与ER共定位的变化。6.采用Sesn2基因敲除小鼠(Sesn2~(-/-)),分离WT及Sesn2~(-/-)小鼠脾脏DC后给予1μg/ml LPS刺激24 h,采用WB、激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜检测并比较RETREG1介导ER-phagy活性的差异;采用WB方法检测WT与Sesn2~(-/-)-DC在1μg/ml LPS刺激下同时给予1μM Rapamycin激活ULK1时RETREG1与SEC61B蛋白表达水平的差异。第四部分:1.分离提取WT及Retreg1~(-/-)小鼠脾脏DC,体外培养中给予1μg/ml LPS刺激细胞24 h,采用Label-free定量蛋白质组学技术对各组之间蛋白进行定量分析;对WT-LPS与Retreg1~(-/-)-LPS两组差异蛋白进行生物信息学分析,包括GO功能注释、KEGG通路功能分类及Reactome/Wiki Pathways通路富集分析等。2.体外实验中,采用1μg/ml LPS刺激WT及Retreg1~(-/-)小鼠脾脏DC,通过激光共聚焦显微镜观察内质网形态;应用WB方法检测DC中ERS相关蛋白及EIF2AK3-ATF4-DDIT3信号通路分子表达水平;采用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)试剂盒及酶标仪检测培养上清液中ROS含量。3.分离提取小鼠脾脏DC,给予2μg/ml衣霉素(Tunicamycin,Tm,ERS特异性激动剂)刺激DC,流式细胞术、STYOX Green染色、激光共聚焦显微镜及ELISA检测DC坏死性凋亡水平。同时,应用WB方法分析坏死性凋亡及EIF2AK3-ATF4-DDIT3信号通路活化状态。4.在体外实验中,分离提取WT及Retreg1~(-/-)小鼠脾脏DC,体外细胞培养中20μM Salubrinal(EIF2A去磷酸化抑制剂)预处理后采用1μg/ml LPS+20μM z VAD联合刺激细胞24 h,应用流式细胞术、STYOX Green染色、WB和激光共聚焦显微镜检测各组DC坏死性凋亡活化改变。5.体内实验中,Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)及Retreg1~(fl/fl)小鼠于CLP术前1 h腹腔注射2 mg/kg Salubrinal,术后24 h分离脾脏DC,采用流式细胞术比较DC表面分子CD80、CD86及MHC-II表达水平差异;观察CLP术后各处理组7 d生存情况。结果第一部分:1.与对照组比较,CLP术后24 h小鼠脾脏DC坏死性凋亡率显著上升,坏死性凋亡相关蛋白RIPK1、RIPK3及MLKL磷酸化程度显著增强,且在CLP后72 h脓毒症小鼠脾脏DC坏死性凋亡水平达峰值。相较对照组及单纯LPS刺激组,WT小鼠脾脏DC在LPS+z VAD联合刺激24 h呈现明显的坏死性凋亡率及坏死细胞比例升高,坏死性凋亡相关蛋白水平上调,p-MLKL及p-RIPK3荧光强度增加且阳性细胞比例增加;同时,培养上清液中IL-1α、IL-33、HMBG1、TNF-α及LDH释放增多。2.在体外及体内实验中给予Nec-1预处理均可有效缓解脓毒症诱导DC坏死性凋亡水平,显著改善脓毒症小鼠CLP术后7 d生存率。3.脓毒症状态下,DC表面功能分子CD80、CD86、MHC-II表达及IL-12分泌水平于CLP术后24 h代偿性增高,在脓毒症72 h则明显降低。CLP术后24 h脾脏DC与T细胞共培养后,其刺激T细胞增殖活性增加,IL-2及IFN-γ含量升高,而IL-4水平下降,IFN-γ/IL-4比值上升;而脓毒症72 h分离的DC则呈现相反趋势,表现为共培养体系中T细胞增殖能力显著减弱,IL-2及IFN-γ表达出现下降趋势,但IL-4分泌显著增加,IFN-γ/IL-4比值显著降低。相较假伤组小鼠,脓毒症24-72 h小鼠PBMCs中CD3~+T、CD4~+T细胞比例持续下降,T细胞中CD4~+FOXP3~+Tregs细胞占比则进一步增加,均于CLP术后72 h达峰值;CLP术后24 h血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及selleckTGF-β水平均明显升高,IFN-γ/IL-4比值上升;而脓毒症72 h小鼠血清中IL-2及IFN-γ分泌量显著下调,IL-4、IL-10及TGF-β水平则明显上升,IFN-γ/IL-4比值较假伤组及CLP 24 h组均明显降低。4.体外采用LPS+z VAD诱导坏死性凋亡发生可显著降低DC表面功能分子表达强度,且其对T细胞免疫反应的激动效应呈显著抑制。5.LPS刺激及CLP手术后24 h,RETREG1及LC3-II/LC3-I转化率明显上调,SEC61B水平显著下降,且ER与自噬体及溶酶体的共定位均显著增强,含内质网结构的自噬体明显增多。而当脓毒症持续存在时,RETREG1介导的ER-phagy活性则明显减弱。第二部分:1.脓毒症状态下,Retreg1~(-/-)小鼠DC凋亡率较WT小鼠显著下降,凋亡相关蛋白Cleaved CASP3下调且凋亡/抗凋亡蛋白比值BAX/BCL2下降。LPS联合Nig刺激后Retreg1~(-/-)小鼠DC细胞焦亡率明显下降,炎性小体(NLRP3、ASC)及焦亡相关蛋白(CASP1 p10/p12、GSDMD-N/GSDMD-full)相对表达水平均下调,培养上清液中IL-1β及IL-18分泌量显著下调。2.在体内及体外实验中,Retreg1~(-/-)小鼠脾脏DC坏死性凋亡水平较WT-DC显著上升,表现为DC坏死性凋亡率及坏死DC占比上升;坏死性凋亡相关蛋白RIPK1/3、MLKL磷酸化水平增强,p-MLKL及p-RIPK3阳性细胞比例增加;体外培养上清液中IL-1α、IL-33、HMBG1、TNF-α及LDH分泌量增多。同时,Retreg1~(-/-)脓毒症小鼠在CLP术后24 h心、肝、肺、肾的器官损伤明显加重,且术后7 d生存率较WT脓毒症小鼠显著下降。3.Nec-1预处理细胞后,脓毒症时Retreg1~(-/-)小鼠DC坏死性凋亡率、坏死性凋亡相关蛋白表达及p-MLKL细胞比例的上调均受到抑制,显著低于单纯LPS+z VAD处理组。4.与Retreg1~(fl/fl)小鼠脾脏DC在CLP术后24 h显著上调DC表面分子表达不同,Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)小鼠CLP术后CD80、CD86、MHC-II表达较假伤组显著下调,同时也明显低于Retreg1~(fl/fl)-CLP组;与Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)脓毒症小鼠DC共培养CD4~+T细胞增殖能力较Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)假伤组及Retreg1~(fl/fl)-CLP组均呈现显著下降;共培养体系中IL-2、IL-12及IFN-γ分泌量明显降低,IL-4分泌量增加,且IFN-γ/IL-4比值显著下降。相比Retreg1~(fl/fl)脓毒症小鼠,Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)小鼠CLP术后24 h CD3~+T细胞及CD4~+T细胞在PBMCs中占比显著降低,而Tregs细胞占比则显著扩大;外周血IL-2及IFN-γ水平降低,而IL-4、IL-10、TGF-β水平显著上升,IFN-γ/IL-4比值下降。Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)小鼠CLP术后7 d生存率显著低于Retreg1~(fl/fl)小鼠。5.Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)小鼠CLP术后给予Nec-1处理后,DC表面功能分子表达均较CLP组明显增强;PBMCs中CD3~+T细胞及CD4~+T细胞占比明显回升,Tregs细胞占比则显著下降;外周血IL-2及IFN-γ水平显著上升,IL-4、IL-10、TGF-β水平明显下降,IFN-γ/IL-4比值回升;CLP术后7 d生存率显著改善。第三部分:1.LPS刺激DC 24 h后,UPR通路信号分子(HSPA5、EIF2AK3、EIF2A、ATF4、DDIT3、ERN1、XBP1、ATF6)表达均显著上调;当脓毒症持续存在时,Ewww.selleck.cn/products/sbe-b-cdIF2AK3及EIF2A磷酸化水平、HSPA5、ATF4、DDIT3蛋白水平相比LPS刺激24 h进一步增强,而ATF6表达水平显著下调,ERN1及XBP1蛋白表达水平则未见明显改变。2.采用AEBSF预处理细胞而非Salubrinal、4μ8C能显著抑制LPS刺激下小鼠脾脏DC中RETREG1蛋白水平及Retreg1 m RNA水平的上调。3.相较WT-DC,Atf6~(-/-)-DC在LPS刺激下RETREG1蛋白表达及Retreg1 m RNA水平均明显降低,溶酶体与内质网共定位显著减弱;内质网周边自噬体的形成及数量未见增多,含内质网结构的自噬体数目无明显增加。4.在HEK293T细胞中,ATF6可结合Retreg1上游启动子序列;突变Retreg1上游启动子序列中的三处预测位点显著影响其与ATF6的结合效率。在Lhigh-dimensional mediationPS刺激下小鼠脾脏DC中,ATF6结合DNA区域的Reads显著富集在转录起始位点附近,其Peak主要位于启动子到转录起始位点小于1000 bp的区域内;Peak邻近基因主要富集于细胞自噬、内质网蛋白加工过程、AMPK信号通路、m TOR信号通路及线粒体自噬等信号通路;15号染色体上Retreg1基因转录起始位点附近存在ATF6的结合峰(Peaks 2242)。5.LPS刺激的同时给予Rapamycin处理能显著增加小鼠脾脏DC中ULK1及BECN1磷酸化水平,且RETREG1蛋白表达水平较单纯LPS刺激组显著升高,SEC61B则明显下调。GW406108X预处理细胞可显著下调LPS刺激后p-ULK1及p-BECN1水平,并同时降低RETREG1蛋白表达水平;LPS刺激同时给予Rapamycin或GW406108X处理可分别增强和减弱BECN1与内质网的共定位。在LPS刺激下,Becn1~(+/-)小鼠DC中RETREG1蛋白表达水平相比WT小鼠显著降低,而SEC61B表达水平则明显升高;溶酶体与内质网共定位较WT-DC呈减弱变化。6.Sesn2~(-/-)小鼠脾脏DC在LPS刺激下ULK1及BECN1磷酸化水平较WT小鼠脾脏DC显著下降,RETREG1表达明显下调,SEC61B表达则上升;溶酶体与内质网共定位强度显著降低,未在内质网周边观察到自噬体的形成以及含内质网结构的自噬体或自噬小体。在Sesn2~(-/-)小鼠脾脏DC中LPS+Rapamycin联合刺激后RETREG1蛋白表达水平较LPS单纯刺激组显著增高,SEC61B水平则明显下调。第四部分:1.LPS刺激下WT-DC与Retreg1~(-/-)-DC差异表达蛋白中包含492个上调蛋白及337个下调蛋白;差异蛋白显著富集的BP条目包括超氧化物代谢调控、蛋白靶向膜转运调控、免疫球蛋白介导的免疫反应等;富集的CC条目包括粗面内质网管腔、顺式高尔基体等;富集的MF包括神经肽受体活动、MHC-II蛋白复合体结合、免疫球蛋白结合、肽类激素结合等。WT-LPS与Retreg1~(-/-)-LPS差异蛋白显著富集于细胞生存与死亡、信号转导、信号分子相互作用、蛋白折叠/分选/降解、翻译、免疫系统等KEGG通路功能分类。2.LPS刺激Retreg1~(-/-)-DC内质网形态较WT-DC处理前后改变更为剧烈,内质网形态呈现不规则扭曲、膨胀且碎裂更为明显;EIF2AK3-ATF4-DDIT3信号通路相关蛋白EIF2AK3及EIF2A磷酸化、HSPA5、ATF4及DDIT3水平均明显上调;培养体系中ROS释放水平显著增加。3.体外给予Tm刺激后,小鼠脾脏DC中EIF2AK3-ATF4-DDIT3信号通路相关分子表达及坏死性凋亡相关蛋白磷酸化水平均较对照组显著增强,坏死性凋亡率及坏死细胞比例上升,p-MLKL及p-RIPK3表达强度、p-MLKL/p-RIPK3阳性细胞比例显著增加;培养上清液中IL-1α、IL-33、HMBG1、TNF-α及LDH含量升高。4.Salubrinal预处理细胞可有效降低LPS+z VAD联合刺激下WT-DC及Retreg1~(-/-)-DC中EIF2AK3-ATF4-DDIT3信号通路及坏死性凋亡的活化。5.腹腔注射Salubrinal后,Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)脓毒症小鼠DC表面功能分子CD80、CD86及MHC-II表达水平较CLP组显著回升;Retreg1~(fl/fl)脓毒症小鼠DC表面分子水平较CLP组进一步上调;Salubrinal处理后Cd11c~(cre)Retreg1~(fl/fl)小鼠CLP术后7 d生存率较未给药组明显提高。结论本实验结果证实,脓毒症状态下DC可发生显著的RIPK1-RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡,与DC免疫功能障碍及脓毒症动物外周免疫抑制密切相关。RETREG1介导的ER-phagy可通过负向调控EIF2AK3-ATF4-DDIT3-ROS信号轴,抑制脓毒症时DC坏死性凋亡并维持其免疫功能活化状态,对脓毒症动物发挥保护效应。脓毒症时ATF6及SESN2-ULK1-BECN1信号通路在调控ERS与RETREG1介导的ER-phagy联动中发挥重要作用。

RETREG1介导内质网自噬对脓毒症时树突状细胞坏死性凋亡的保护效应及机制研究

木薯查尔酮合酶MeCHS基因家族特征与表达分析

查尔酮合酶（chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径的第一个限速酶，在植物Herpesviridae infections花色形成、生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要作用。为明确木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯块根采后腐烂（PPD）中的表达，本研究利用生物信息学方法对木薯MeCHS基因家族成员进行理化性质、蛋白质结构等分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeCHS基因在不同品种、不同组织及块根PPD过程中的表达情况，同时克隆并构建3个高表达的MeCHS基因的亚细胞定位载体并进行烟草瞬时转化以确定其定位。在木薯基因组中共鉴定出5个MeCHS基因家族成员，蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。qRT-PCR分析发现：MeCHS基因表达具有明显的组织特异性，在茎中表达水平最高；在木薯中主要表达的MeCHS基因为MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3，且3个基因随着SCR428溶解度8块根贮藏时间的延长表达量逐步升高。将成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因经农杆菌介导CH-223191化学结构瞬时转化烟草下表皮细胞，显微观察表明3个基因均定位于细胞质，与预测结果相符。该研究结果可为进一步揭示木薯MeCHS基因家族的功能与提高木薯块根耐PPD能力提供理论依据。

低分子肝素联合利伐沙班在预防下肢骨折患者下肢深静脉血栓形成中的应用

目的：探讨低分子肝素联合利伐沙班在预防下肢骨折患者下肢深静脉血栓形成Tofacitinib中的应用价值。方法：选取行手术治疗的58例下肢骨折患者为研究对象。随机分为对照组与观察组各29例。对照组单纯使用低分子肝素治疗，观察组在此基础上加用利伐沙班治疗。比较两组患者术后1 d凝血功能指标[凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、D二聚体(D-D)、组织型纤溶酶原激活剂抗原(tPA-Ag)]检测结果、感染指标[C-反应蛋白(CRP)、白细胞计数(WBC)、降钙素原(PCT)、白细胞介素-6(IL-6)]检测结果、术后下肢肿胀改善时间、术后疼痛改善时间、术后住院时间以及术后并发症(下肢深静脉血栓形成、静脉血栓栓塞、肺栓塞)情况的差异。结果：观察组术后1 d PT、APTT、FIB、tPA-Ag检测结果均高于对照组，D-D检测结果低于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05);观察MRTX1133组术后1 d CRP、WBC、PCT、IL-6检测结果均低于对照组，两组比较比差异有统计学意义(P<0.05);观察组术后下肢肿胀改善时间、疼痛改善时间及住院时间均短于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05);观察组术后下肢深静脉血栓形成hereditary risk assessment发生率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);两组静脉血栓栓塞、肺栓塞发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：低分子肝素联合利伐沙班能够改善下肢骨折患者凝血功能和感染指标，预防下肢深静脉血栓形成，促进术后恢复。

肠炎宁颗粒联合蒙脱石散治疗小儿轮状病毒性肠炎的临床研究

目的观察肠炎宁颗粒联合蒙脱石散治疗小儿轮状病毒性肠炎的临床情况。方法选取2020年3月—2021年7月海南医学院第二附属医院收治的130例小儿轮状病毒性肠炎患儿，采用随机数字表法将所有患儿随机分为对照组和治疗组，每组各65例。对照组口服蒙脱石散，6个月以下患儿每次1/3袋，1～2岁患儿每次2/3袋，3岁以上患儿每次1袋，3次/d。治疗组在对照组基础上口服肠炎宁颗粒，6个月以下患儿每次1/3袋，1～2岁患儿每次2/3袋，3岁以上患儿每次1袋，3次/d。两组患儿治疗时间均为5d。比较两组临床疗效、主要症状改善时间、中医症候评分、血清炎症因子和肠道菌群。结果治疗后，治疗组患儿总有效率显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后，治疗组的退热时间、止泻时间、止吐时间明显购买NSC 127716短于对照组（P<0.05）。治疗后，两组患儿大便清稀、低热、呕吐、食欲不振、腹胀、口渴评分较治疗前下降明显（P<0.05），且治疗组中医症候评分降低更显著（Bioavailable concentrationP<0.05）。治疗后，两组血清C反应蛋白（CRP）、白细BMN 673溶解度胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平均显著降低（P<0.05），治疗组血清炎症因子水平较对照组更低（P<0.05）。经治疗，两组双歧杆菌、嗜酸乳杆菌较治疗前显著增加，大肠杆菌均显著下降（P<0.05），治疗组双歧杆菌、嗜酸乳杆菌较对照组更高，大肠杆菌较对照组更低（P<0.05）。结论肠炎宁颗粒联合蒙脱石散可有效治疗小儿轮状病毒性肠炎，改善临床症状和中医症候，其作用机制可能与调节肠道菌群、抑制炎症等有关。

白介素8与良性前列腺增生手术安全性及效果的相关性研究

目的:探究前列腺液中白细胞介素(Interleukin,IL)-8的浓度与良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)临床资料、手术安全性及治疗效果之间的相关性,为BPH的诊治提供新的思路,为BPH患者手术安全性和预后的评估提供新的临床依据。方法:收集2021年11月-2022年8月在江汉大学附属医院泌尿外科确诊为良性前列腺增生且行经尿道前列腺等离子双极电切术的患者64例。按入院流程收集患者基本临床资料,测定患者血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)、C反应蛋白浓度、血红蛋白浓度,对患者术前国际前列Z-IETD-FMK使用方法腺症状评分(International Prostate Symptoms Score,IPSS)及生活质量评分(quality of life,QOL)进行评估,测定患者前列腺体积大小、残余尿量、术前最大尿流率。所有患者术前通过前列腺按摩留取前列腺液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)对前列腺液中IL-8的浓度进行测定。所有患者根据前列腺增生诊断治疗指南诊断有手术指征并完成手术治疗。术后留置三腔导尿管持续膀胱冲洗,待膀胱冲洗清亮后停止冲洗,尿液清亮后拔除导尿管,观察患者排尿情况,颜色是否清亮,是否发生尿潴留及尿失禁等。出院3个月后再次测定患者最大尿流率,评估患者IPSS评分及QOL评分。记录各项观察指标,并进行统计学相关性分析和回归分析。结果:1.前列腺液中IL-8的浓度与术前患者膀胱残余尿(r=0.83)、血清C反应蛋白浓度(r=0.61)、IPSS评分(r=0.75)、QOL评分(r=0.78)、既往发生过尿潴留(r=0.77)呈明显正相关,与患者最大尿流率(r=-0.90)关系最密切,呈负相关。与患者年龄(r=0.41)和血清PSA(r=0.60)中度相关,差异具有统计学意义(p<0.001)。BPH患者前列腺体积(r=0.18)与前列腺液中IL-8浓度相关性不密切,差异无统计学意义(p=0.150,p>0.05)。2.BPH患者前列腺液中IL-8浓度与患者术中出血量(r=0.87)、术后膀胱冲洗时间(r=0.95)有显著的相关性,与患者手术时间(r=0.67)、留置导尿时间(r=0.73)也相关明显,均呈正相关。差异具有统计学意义(p<0.001)。与术后未出现并发症的患者相比,发生并发症患者的前列腺液中IL-8浓度相对较高。3.患者术后最大尿流率、IPSS评分、QOL评分改善明显,差异具有统计学意义(p<0.001)。患者最大尿流率变化率(r=0.76)、QOL评分变化率(r=-0.73)与患者前列腺液IL-8浓度相关性明显,而与IPSS评分变化率(r=-0.38)有中度相关性。差异具有统计学意义(p<0.001)。前列腺液IL-8浓度与患者最大尿流率变化率呈明显正相关性,与QOL评分变化率、IPSS评分变化率呈明显负相关性,差异具有统计学意义(p=0.002、p<0.001)。结论:前列腺液中IL-8浓度与BPH患者术前膀胱残余尿、C反应蛋白浓度、PSA水平、IPSS评分、QOL评分、既往发生过尿潴留,以及术中出血量、手术时间、术后膀胱冲洗和留置导尿的时间呈明显正相关。与患者术前最大尿流率、术后IPSS评分和QOL评分变化率BMS-907351纯度呈明显负相关,而与患者前列腺体积没有明显相关性。表明前列腺液中IL-8浓度升高可能提示BPH患者临床症状更重,手术安全性和手术效果可能不及预期。因此,ILsecondary infection-8有可能为BPH的诊治提供一种无创性的检测方法,为BPH患者治疗方式的选择以及预后的评估提供新的可靠的临床依据。

基于PKA信号通路探讨胆南星对MPTP诱导帕金森病模型小鼠的保护作用

目的探讨胆南星对帕金森病（PD）模型小鼠的改善作用及可能机制。方法将60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、胆南星低剂量组[0.39 g/（kg·d）]、胆南星高剂量组[1.56 g/（kg·d）]和阳性对照药左旋多巴片组[80 mg/（kg·d）]，每组12只。除正常组小鼠注射等体积生理盐水外，其余各组连续5 d腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶[MPTP,35 mg/（kg·d）]建立亚急性PD模型；造模完成后连续给药治疗7 d，于造模前1 d、造模第5天和末次给药后进行爬杆实验和线悬挂测试。采用免疫荧ABT-263价格光法检测小鼠脑黑质中酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量；采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平以及脑黑质中IL-1β、TNF-α、环氧合酶2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平；采用Western blot法检测小鼠脑黑质中cAMP依赖的蛋白激酶催化亚单位α(PKA C-α)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)以及铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的表达。结果末次给药后，与正常组比较，模型组小鼠爬杆时间显著延长（P<0.01），线悬挂评分显著降低（P<0.01），脑黑质中TH阳性神经元数量显著减少（P<0.01），血清中IL-1β、TNF-α水平和脑黑质中IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS水平显著升高（P<0.01），脑黑质中GPX4、PKA C-α和FTH1蛋白表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，胆南星高剂量组小鼠上述指标水平均显著回调（P<0.05或P<0.01）。结论胆南星能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动能力障碍，减少脑黑质TH神经元Telaglenastat IC50死亡，对模型小鼠具有神经保护作用；这可能与其激活PKA信号通路来抑制神经炎症和神经元Biotoxicity reduction细胞铁死亡有关。

lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1在急性淋巴细胞白血病患儿血清中的表达水平及相关性分析

目的探讨长链非编码RNA MAGF-AS1(lncRNA MAFG-AS1)、长链非编码RNA RPPH1(lncRNA RPPH1)在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患儿血清中的表达水平，并分析其与病理学参数的相关性。方法选取83例ALL患儿作为ALL组，83例非恶性血液病患儿作为非恶性血液病组，同期83例健康体检儿童作为对照组。比较3组研究参与者入院时血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平，不同病理学参数ALL患儿血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平比较，分析血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平与病理学参数的相关性，受试者操作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平联合检测对ALL的诊断价值。结果入院时ALL组血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平>非恶性血液病组>对照组，差异有统计学意义(P<0.05);ALL患儿血清lncRNA MAFG-AS1、lncRSAHA molecular weightNA RPPH1表达水平比较：白细胞计数<50×10~9 L~(-1)患儿低于白细胞计数≥50×10~9 L~(-1)患儿，乳酸脱氢酶(LDH)水平<250 U·L~(-1)患儿低于LDH水平≥250 U·L~(-1)患儿，有淋巴结肿大患儿高于无淋巴结肿大患儿，低危型患儿<中危型患儿<高危型患儿(P<0.05);ALL患儿血清lncRNA MAFG-AS1表达水Blood-based biomarkers平与白细胞计数、LDH水平、淋巴结肿大、危险度分层呈正相关(r=0.671、0.699、0.704、0.583,P<0.05);ALL患儿血清lncRNA RPPH1表达水平与白细胞计数、LDH水平、淋巴结肿大、危险度分层呈正相关(r=0.711、0.645、0.596、0.607,P<0.05);以ALL患儿DS-3201分子量为阳性标本，以非恶性血液病患儿为阴性样本，绘制ROC曲线，入院时血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平联合诊断ALL的曲线下面积(AUC)为0.802(95%CI:0.746～0.863),优于各指标单一诊断。结论血清lncRNA MAFG-AS1、lncRNA RPPH1表达水平与ALL患儿病理学参数有关，二者联合检测对ALL诊断具有较高价值。

基于SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的左归丸加红曲方治疗骨质疏松症模型大鼠的机制研究

研究背景骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨代谢紊乱疾病,随着人口老龄化的发展,OP发病率明显升高,其并发性骨折的严重后果对绝经后女性的身体健康和生活质量构成了严重威胁。OP成为全球公共卫生问题。根据中医理论,肾Q-VD-Oph配制藏精,主骨,生髓。肾精充足,则骨髓化生有源,骨骼得其滋养而强劲有力;肾精亏虚,则骨髓化生乏源,骨骼失其所养而痿软无力,故要补肾填精。左归丸是中医著名的“补肾”方剂,出自《景岳全书》,大量临床、动物实验研究证实了左归丸的抗骨质疏松效应。红曲具有燥胃消食降浊,活血和血而散伤功效,实验证实了红曲能够减少破骨细胞分化,促进骨形成。本研究在左归丸原方基础上加红曲,即左归丸加红曲方,本课题预实验证实,左归丸加红曲方减少去卵巢大鼠骨丢失效果优于左归丸,但目前其机制尚未完全清楚。随着“肠-骨”轴概念的提出,肠道菌群、短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)与骨代谢的相关性不断得到证实。OP伴有肠道菌群的改变,肠道菌群的失调也会加重或导致OP,SCFAs由肠道菌群酵解肠道中碳水化合物而来。SCFAs可调节p38MAPK通路抑制破骨细胞(Osteoclast,OC)分化;SCFAs与OC表面的特异性受体GPR41结合,抑制p38MAPK-NFATc1破骨细胞分化通路,抑制前体细胞分化为成熟OC。因此我们选择经典的OC相关通路:SCFAs-GPR41-p38MAPK作为本研究的通路。因此,我们做出如下科学假设:左归丸加红曲方是否调控SCFAs-GPR41-p38MAPK通路发挥抗骨质疏松效应?第一部分:左归丸加红曲方对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用及对SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响实验方法1.制备OP大鼠模型,SD雌性大鼠分为空白对照组(NC)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、戊酸雌二醇组(EV,0.018mg/mL)、左归丸(ZGW,0.945g生药/mL)、左归丸加红曲方组(ZH,1.08g生药/mL)。观察大鼠阴道涂片、称取大鼠体重、子宫湿重来评估造模情况。通过Micro-CT检测大鼠骨密度(BMD)、检测骨组织形态计量学指标、观察骨组织病理改变(HE染色和TRAP染色)2.各组大鼠血清TRAP、BALP和BGP水平(ELISA检测法)、骨吸收相关指标 OPG、RANKL、CTSK、TRAP mRNA(qRT-PCR检测法)和 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白(WB和IHC检测法)表达情况。3.通过16S rRNA基因测序技术检测各组大鼠粪便微生物多样性变化。通过各组大鼠肠道菌群OTU分析图、Alpha和Beta多样性分析观察肠道菌群多样性的变化;在门水平和属水平上分析各组大鼠肠道菌群相对丰度变化和组间差异菌群,观察左归丸加红曲方对去卵巢大鼠肠道菌群多样性和丰度的影响。4.采用气质联用(GC-MS)检测各组大鼠外周血清中SCFAs总量及乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的含量,结合PLS-DA分析、单变量分析、支持向量机分析,观察左归丸加红曲方对去卵巢大鼠外周血清中SCFAs及差异代谢物的影响。5.qRT-PCR法检测各组大鼠骨组织p38mRNA表达情况;IHC法检测各组大鼠骨组织p38蛋白和WB法检测各组大鼠骨组织GPR41、P-p38蛋白的表达情况,探索左归丸加红曲方对去卵巢大鼠SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响。实验结果1.各组大鼠一般情况表现。造模12周后,假手术大鼠阴道涂片呈现动情前期-动情期-动情后期-动情间期的规律周期变化。去卵巢大鼠阴道涂片呈现持续间期特征,规律动情周期消失。与SHAM组比较,OVX组大鼠体重显著增加(p<0.01);与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组大鼠体重明显下降(p<0.01)。与SHAM组比较,OVX组大鼠子宫系数显著降低(p<0.01);与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组子宫系数无统计学差异(p>0.05)。由此可知本实验造模成功。与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组大鼠BMD、BV/TV 明显提高(p<0.01);Tb.N 显著增加,Tb.Sp 显著降低(p<0.01;p<0.05)。HE染色显示OVX组大鼠骨组织骨小梁结构排列稀疏,结构紊乱,连接性差,且TRAP染色表现为酒红色染色分布较多且明显;EV组、ZGW组、ZH组大鼠骨微结构破损状况均有所改善。2.各组大鼠血清骨转换标志物及骨吸收相关指标的表达情况。ELISA检测结果显示,与OVX组比较,ZH组明显降低TRAP、BALP和BGP水平(p<0.01;p<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组OPG mRNA表达显著上调(p<0.01),RANKL、CTSK、TRAP 和 RANKL/OPG mRNA 表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。IHC检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组c-FOS、CTSK、TRAP蛋白表达显著下调(p<0.01;p<0.05)。WB检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。3.各组大鼠肠道菌群多样性的变化。由肠道菌群OTU分析、Alpha和Beta多样性分析可知去卵巢后大鼠肠道菌群多样性发生显著变化,以门水平和属水平肠道菌群变化为例,左归丸加红曲方逆转拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)、Gemmatimonadota、酸杆菌门(Acidobacteriota)、粘球菌门(Myxococcota)5种菌门变化,以及Muribaculaceae、普雷沃菌属(Prevotella)、普雷沃氏菌科 Ga6A1_group 属(Prevotellaceae_Ga6A1_group)、UCG-005、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)5种菌属的变化;由各组大鼠肠道菌群相对丰度变化可知,拟杆菌门和厚壁菌门是门水平的优势菌群,普雷沃氏菌属、拟杆菌属等是属水平的优势菌群,其在各组的相对丰度发生改变。4.各组大鼠肠道菌群代谢物SCFAs含量的变化。与OVX组比较,EV组、ZH组大鼠血清SCFAs总量明显升高(p<0.01)。与OVX组比较,EV组、ZH组戊酸、异戊酸、己酸含量明显升高(p<0.01;p<0.05),其余的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸表现为相同的表达。结合PLS-DA分析、单变量分析和支持向量机分析结果,己酸和异戊酸可能是SCFAs介导的左归丸加红曲方发挥抗骨质疏松作用的关键代谢物。5.SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路确认细节关键因子的表达情况。ZH可激活SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路,显著下调信号通路上p38基因和蛋白表达(p<0.01);提高GPR41蛋白表达、降低磷酸化p38蛋白表达(p<0.05)。第二部分:左归丸加红曲方血清和短链脂肪酸对破骨细胞和SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响实验一:左归丸加红曲方血清用药浓度的筛选实验方法1.制备血清:空白血清组(Serum-NC)、模型血清组(Serum-OVX)、左归丸加红曲方血清组(Serum-ZH)。2.将小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞经RANKL诱导为OC,用TRAP染色进行鉴定。采用CCK-8法筛选左归丸加红曲方血清的安全用药范围。3.采用TRAP染色,观察并计算各组TRAP+破骨细胞个数(细胞核≥3个);对骨片进行骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积,确定左归丸加红曲方血清的最佳用药浓度。实验结果1.成功诱导OC。加入RANKL后,镜下观察RAW264.7细胞逐渐融合汇聚,体积增大,并伴有大小不等的囊泡状结构出现。经TRAP染色后,颜色为紫红色、形态多核(细胞核≥3个)者鉴定为成熟OC。2.不同浓度左归丸加红曲方血清对细胞活性的影响。采用CCK-8检测法,确定0%-5%浓度范围的左归丸加红曲方血清对RAW264.7细胞未产生毒性,是安全用药范围。3.不同浓度左归丸加红曲方血清对OC分化的影响。TRAP染色结果显示,与模型血清组比较,不同浓度(2.5%、5%)左归丸加红曲方血清组TRAP+破骨细胞数量均有不同程度的减少(P<0.01),但5%浓度的左归丸加红曲方血清组TRAP+破骨细胞数量减少更明显(P<0.01)。4.不同浓度左归丸加红曲方血清对OC骨吸收功能的影响。与模型血清组比较,不同浓度(2.5%、5%)左归丸加红曲方血清组骨吸收陷窝面积均明显减少(P<0.01),但5%左归丸加红曲方血清组骨吸收陷窝面积减少程度更大。实验二:左归丸加红曲方血清和短链脂肪酸对破骨细胞的影响实验方法1.按照在体实验不同组别外周血中SCFAs含量和比例,采用体外模拟的方法,制备对应组外周血浓度(1×)和骨髓浓度(10×)的SCFAs。实验分组如下:1 × SCFAs-NC、1 × SCFAs-OVX、1×SCFAs-ZH、10×SCFAs-NC、10×SCFAs-OVX、10×SCFAs-ZH。大鼠血清分组:Serum-NC、Serum-OVX、Serum-ZH。2.采用TRAP染色,观察并计算各组TRAP+破骨细胞个数(细胞核≥3个);对骨片进行骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积,观察各组大鼠血清和SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响。3.采用qRT-PCR法和WB法检测信号通路关键因子GPR41、p38及OC相关指标基因和蛋白的表达情况。实验结果1.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响1.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组明显减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.01),而1 ×SCFAs-OVX组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积效果不及Serum-OVX组(p<0.01);与Serum-ZH组比较,1 ×SCFAs-ZH组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积效果不及Serum-ZH组(p<0.01)。1.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响与1 × SCFAs-OVX组比较,1 × SCFAs-ZH组明显减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.01),10×SCFAs-OVX组减少TRAP+破骨细胞数量(p<0.01)和骨吸收陷窝面积(p<0.05)的程度更明显;与1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.05)效果更优。2.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC相关基因表达的影响2.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对破骨细胞NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达的影响与 Serum-OVX 组比较,Serum-ZH 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达明显下调(p<0.01;p<0.05),而 1 ×SCFAs-OVX 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达明显上调(p<0.01)。与 Serum-ZH组比较,1 ×SCFAs-ZH 组NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达明显上调(p<0.01)。2.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对破骨细胞NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达的影响与 1 ×SCFAs-OVX 组比较,1 ×SCFAs-ZH 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达明显下调(p<0.01),10×SCFAs-OVX 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达也明显下调(p<0.01;p<0.05);与 1 × SCFAs-ZH 组比较,10×SCFAs-ZH 组显著下调 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达(p<0.01)。3.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC相关蛋白表达的影响3.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对破骨细胞c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达的影响与 Serum-OVX 组比较,Serum-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05);1×SCFAs-OVX 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1 × SCFAs-ZH组c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显上调(p<0.01)。3.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对破骨细胞c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达的影响与 1 × SCFAs-OVX 组比较,1 × SCFAs-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01);10×SCFAs-OVX 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显下调(pDNA Purification<0.01;p<0.05)。与 1 × SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。4.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对通路关键因子基因和蛋白表达的影响4.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对通路关键因子p38mRNA和GPR41、P-p38蛋白表达的影响与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组p38 mRNA表达明显下调(p<0.01),而1 × SCFAs-OVX组p38 mRNA表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1 × SCFAs-ZH 组 p38 mRNA 表达明显上调(p<0.01)。与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.01);1 ×SCFAs-OVX组GPR41蛋白表达明显下调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显下调(p<0.05),P-p38蛋白表达明显上调(p<0.01)。4.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对通路关键因子p38mRNA和GPR41、P-p38蛋白表达的影响与1 × SCFAs-OVX组比较,1 × SCFAs-ZH组p38 mRNA表达明显下调(p<0.01),10×SCFAs-OVX 组 p38 mRNA 表达也明显下调(p<0.01);与 1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组显著下调 p38 mRNA表达(p<0.01)。与1 × SCFAs-OVX组比较,1 ×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.05),P-p38 蛋白表达明显下调(p<0.01);10×SCFAs-OVX 组 GPR41 蛋白表达明显上调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.05)。与1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.05),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.05)。实验结论1.左归丸加红曲方可有效改善OP,该效应的发挥与肠道菌群结构的改善,SCFAs含量的提高,SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路关键因子的上调有关。2.左归丸加红曲方干预所致的SCFAs变化可有效抑制破骨细胞分化,该抑制效应是左归丸加红曲方抗骨质疏松效应的一部分。综上,左归丸加红曲方对SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的调控作用可能是改善去卵巢模型大鼠骨质疏松症的机制之一,验证了“肠-骨”轴的关键中介作用。