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粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus),是一种重要木腐菌,主要生于水曲柳、杨树等阔叶树的树干、主枝上,可引起重大经济损失和生态破坏。本研究利用二代测序平台Illumina结合三代测序平台Pac Bio,对粗毛纤孔菌进行了全基因组测序和组装。通过全基因组测序,揭示粗毛纤孔菌的营养模式及相关酶系家族,进一步明确其作为腐烂病菌的致病机制,寻找防治水曲柳干腐病的有效措施,为有效防治木材腐朽病提供基础参考资料。根据预测蛋白质组将粗毛纤孔菌与24个近源的真菌基因组进行比较分析,解析了糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)、糖基转移酶(glycosyltransferasesTorin 1生产商,GTs)、多糖裂解酶(polysaccharide lyases,PLs)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CEs)、碳水化合物结合模块(carbohydrate‐binding modules,CBMs)以及附属活力酶(auxiliary activities,AAs)和细胞色素P450(cytochromes P450)的种类分布。在此基础上分析其与寄主选择和致病性相关的基因,并利用比较基因组学方法,从基因组水平上,探究了粗毛纤孔菌的木质纤维素降解能力。论文同时选取6种杀菌剂对粗毛纤孔菌进行室内毒力测定以及部分药剂田间防效的实验,为水曲柳干腐病防治提供理论参考。本研究取得的主要研究结果如下:(1)粗毛纤孔菌Inonotus hispidus全基因组测序结果表明:基因组大小约40.27Mbp,GC含量为48.74%。组装得到4585个contigs,共注释到7807个蛋白编码基因;同时碳水化合物活性酶(CAZyme)注释结果表明基因组含有383个CAZyme基因,与多孔菌目真菌的基因组CAZyme分布无显著差异。(2)木质素降解功能基因酶类及通路分析显示:共筛选出9类51个木质素降解相关基因,分别为多铜氧化酶、木质素修饰过氧化物酶、葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶、香草醇氧化酶、铜自由基氧化酶、1,4-苯醌还原酶、低聚糖氧化酶、铁还原酶、阿魏酸酯酶这9类,其中有14个基因已注释到3个代谢通路中,与I.hispidus降解木质素密切相关。(3)比较基因组学分析显示:各selleck Compound 3类真菌中均有利用多种AA1家族的多铜氧化酶和多种AA2家族Ⅱ类过氧化物酶,而AA1漆酶家族的数量则存在较大差异。在多孔菌目的真菌中,与木质素降解相关的AA2、AA3和AA5家族显著扩张,重要的木质素降解酶AA8家族在大多数多孔菌目真菌的基因组中有所缺失。在4种不同生态类型的真菌中,降解木质纤维empiric antibiotic treatment素相关的酶系家族的平均数量规律为草腐真菌>白腐真菌>褐腐真菌>共生营养真菌。粗毛纤孔菌与白腐菌所共有的核心基因数目(4616个)最多,但与褐腐菌中木质纤维素降解酶基因数量的平均值(112个)最为接近。四种干腐病菌的CAZymes的数目差异比较明显,CEs家族中的CE10仅在I.hispidus中大量分布。(4)试验共选取6种化学杀菌剂进行粗毛纤孔菌室内抑菌效果测定。室内抑菌试验结果表明:40%苯醚甲环唑对粗毛纤孔菌具有非常高的抑菌活性,EC_(50)值为0.1277μg·m L~(-1);其次是40%腈菌唑,EC_(50)值为1.0954μg·m L~(-1)。(5)经杀菌剂胁迫处理后菌丝生理指标测定结果显示:40%苯醚甲环唑作用时间最早,药效最为迅速,处理后的粗毛纤孔菌的SOD酶活性比同期对照组提高了31.44%,CAT酶活性提高了13.99%,MDA含量提高了15.32%,黑色素含量提高了130.11%。而40%腈菌唑作用时间较晚但抑菌效果持续时间较长,处理后的粗毛纤孔菌的SOD酶活性比同期对照组提高了13.91%,CAT酶活性提高了40.46%,MDA含量提高了23.67%,黑色素含量降低了1.97%。两种药剂均对粗毛纤孔菌有着较强的抑制作用,可作为防治粗毛纤孔菌的首选药剂。(6)田间防效分析结果表明:甲基硫菌灵对粗毛纤孔菌的防治效果为9.09%,百菌清的防治效果为1.89%,甲基硫菌灵的防治效果明显优于百菌清。

以四氯化锆、磷钼酸水合物、1,2,4,5-苯四甲酸和(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷为原料，通过原位合成法及接枝共聚法制得了负载磷钼酸的磺酸基功能化UiO-66(HPMo@UiO-66-SO_3H)。采用XRD、FTIR、SEM、EDS、XPS、N2吸附-脱附和TG-DTG对其进行了表征，将HPMo@UiO-66-SO_3H用于大豆卵磷脂与中碳链脂肪酸（辛酸和癸酸）酯交换合成富含辛酸和癸酸的中碳链结构磷脂，通过正交实验优化了反应条件，考察了HPMo@UiO-66-SO_3H的循环利用性。结果表明，HPMo@UiO-66-SO_3Hbiologically active building block具有介孔结构，并含有大量HPMo和磺酸基活性组分，且组分间的协同作用促进了中碳链结构磷脂的生成；当HPMo@UiO-66-SO_3H含量为大豆卵磷脂、辛酸和癸酸总质量的5%PR-171,m(大豆卵磷脂)∶m(辛酸)∶m(癸酸)=1∶10∶10,50℃下反应4 h时，中碳链脂肪酸接入率高达94.31%（辛酸和癸酸接入PD-0332991分子式率分别为44.21%和50.10%）;HPMo@UiO-66-SO_3H循环利用5次后，活性略微下降。

毛霉菌病是一类由毛霉目真菌感染引起的侵袭性疾病，常见于免疫功能低下患者，Diagnostic biomarker人群发病率每年可达到1.2/100万人，病死率为40%～80%。自印度第二波新冠病毒感染疫情大流行起，世界范围内新冠相关毛霉菌病的发病率明显增加。人类主要通过吸入空气中的毛霉孢子而感染，偶尔通过摄入受污染的食物或创伤性创面接触而感染。增加毛霉菌病发病风险的重要因素包括血液系统恶性肿瘤、糖尿病、造血干细胞移植或实体器官移植受者等。临床类型主要分为鼻脑型、肺型、皮肤型、胃肠型和播散型。毛霉菌病诊断方法有影像学检查、组织病Berzosertib分子式理学、真菌培养、聚合酶链式反应等。预防Galunisertib试剂毛霉菌感染的主要措施包括治疗和管理、医院环境监测、个人安全维护方面，应定期监测血糖水平、避免可能造成外伤的活动、避免经空气和经皮肤传播毛霉孢子、保持个人卫生等。早期诊断、纠正潜在的诱发因素、感染组织的手术清创和适当的抗真菌治疗对于管理毛霉菌病至关重要。通过控制糖尿病、减少免疫抑制剂用量、纠正酸中毒、恢复中性粒细胞、早期手术干预以及两性霉素B给药等措施，患者可能会有更好的预后。

目的 采用Box-Behnken设计—效应面法优化pH敏感主动靶向紫杉醇脂质体（cRPSLP/PTX）处方，制备高包封率的cRPSLP/PTX脂质体。方法 采用薄膜分散法制备脂质体，分别以磷脂浓度（X_1）、脂胆比（X_2）和脂药比（X_3）三个因素作为考察指标，以包封率为评价指标，采用3因素3水平Box-Beclinicopathologic featurehnken设计—效应面法筛选cRPSLP/PTX脂质体的最优处方。将最优处方制备的脂质体通过透析法考察药物的体外释放实验，采用MTT法检测制剂的细胞毒性。结果 最优处方工艺条件为X_1=17.49,X_2=3.87,X _3=8.00，最优处方的预测值和实际值高度一致，表明该工艺可用于制备高包封率的脂质体。体外释放实验表明，相比于普通脂质体，cRPSLP/PTX脂质体selleck合成具有明显的缓释特征并具有pH敏感性。体外细胞毒性的研究表明，cRPSLP/PTNSC 125973X脂质体通过受体介导内吞和pH触发的药物释放，显著地增加紫杉醇对HepG2细胞的细胞毒性。结论 BoxBehnken设计—效应面法可用于优化cRPSLP/PTX脂质体的处方筛选，制备的脂质体具有缓释特性以及较高的细胞毒性。

莽草酸途径是微生物和植物中用来催化生成芳香化合物前体的七步生物合成途径,AROM复合物是酿酒酵母中催化莽草酸途径第二步到第六步的五功能酶复合物。通常认为多功能酶复合物可能存在底物通道效应。前期研Dorsomorphin究结果表明在稀溶液中AROM复合物不存在底物通道效应,AROM复合物的单个酶结构域可以彼此独立发挥作用。AROM复合物所处的真实细胞环境相比于体外稀溶液环境更为复杂,细胞环境内充满了高浓度的各种蛋白和其他物质(核酸、聚糖等),细胞内拥挤的环境可能对AROM复合物产生拥挤效应和化学相互作用,体外稀溶液中得出的实验结论不能完全population bioequivalence适用于细胞内的情况。本研究通过构建和表达AROM、AROC、TrpEG以及AROM的两个突变体(AROM~(M1)、AROM~(M2)),检测了AROM复合物在不同环境下的活性。为研究细胞中的拥挤环境对蛋白产生拥挤效应和化学作用,向缓冲液中加入聚乙二醇-8k、聚蔗糖-70k、BSA、酪蛋白、卵清蛋白、大肠杆菌裂解液体和PMAA以模拟细胞中的拥挤环境。结果表明聚乙二醇-8k和聚蔗糖-70k两种高分子以模拟细胞中的排空效应,发现对AROM复合物的活性没有影响。而利用BSA等蛋白模拟细胞中的拥挤环境时,AROM复合物的活性明显提高。AROM复合物活性在带负电的PMAA中同样得到了明显提高,证明了拥挤环境中的负电荷分子使AROM复合物的活性提高。通过AROM~(M1)、AROM~(M2)两种突变体,验证了PMAA对AROM复合物中DHQD、SD、SK和EPSPS功能酶的催化活性同样有促进作用。通过将AROM复合物固定到纳米级的金纳米粒子和亚微米级的聚LY294002 NMR苯乙烯微球载体表面,探究了AROM复合物在不同尺度载体固定后与游离状态下催化性能的变化,初步结果表明AROM复合物在固定到亚微米-纳米载体后,AROM复合物级联催化的总体活性有所提高。

水稻是重要的粮食作物,叶片衰老的调控对于水稻的产量和品质具有重要的意义。褪黑素(N-乙酰5-甲氧基色胺)是一种重要的植物激素,广泛参与植物的生长、发育阶段转换、逆境响应等生命过程的调节。与此同时,褪黑素也是植物衰老过程中的重要调控因子,研究表明通过施加外源褪黑素可以有效地延缓植物的衰老进程。然而,内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制目前尚不明确。为了阐明内源褪黑素调控水稻叶片衰老的潜在机理,本研究构建了褪黑素合成途径关键基因OsCOMT的转基因材料,通过表型考察和生理指标测定揭示了OsCOMT通过合成褪黑素延缓叶片衰老的功能,进一步通过转录组和表观组学测序,揭示了内源褪黑素延缓叶片衰老的分子机制与表观机理。主要研究结果如下:1.通过对黑暗诱导条件下OsCOMT转基因植株表型考察,发现OsCOMT-OE株系相比于野生型(WT)褪黑素水平升高,衰老延缓,叶绿素含量增加;而OsCOMT-Cas9突变体相较于WT褪黑素水平下降,出现早衰表型,且叶绿素含量下降。外源施加褪黑素能够显著回复OsCOMT-Cas9突变体的早衰表型,其褪黑素水平和叶绿素含量均恢复到WT水平。结果表明内源褪黑素含量降低是OsCOMT-Cas9突变体提前衰老的原因。2.通过检测氧化还原水平和生理指标,发现OsCOMT-Cas9突变体相比于WT积累了更多的过氧化氢(H2O2),细胞活性显著降低,且过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著降低。表明内源褪黑素BMS-907351水平的降低负调控细胞抗氧化活性,进而导致早衰表型。3.为了明确内源褪黑素调控水稻叶片衰老的分子机制,对OsCOMT-Cas9突变体和WT水稻幼苗进行转录组测序,差异基因(DEGs)富集分析结果显示OsCOMT-Cas9突变体相较于WT表达上调的差异基因主要富集在转录调控、RNA合成、胁迫响应途径、信号转导以及茉莉酸信号途径上;而表达下调的差异基因主要富集在光合作用相关途径、蛋白质的生物合成途径、氧化还原过程、脂质和有机酸代谢中。同时,在外源褪黑素处理后OsCOMT-Cas9突变体的基因表达水平得到了一定的恢复。结果表明在暗诱导叶片衰老过程中,褪黑素含量的降低导致了转录组的显著变化,且褪黑素在叶片衰老的转录重编程中起着重要作用。4.为了明确黑暗诱导叶片衰老过程中内源褪黑素对全基因组DNA甲基化水平的影响,对暗诱导下的WT以及OsCOMT-Cas9突变体进行了全基因组甲基化测序。结果显示在暗诱导衰老过程中,OsCOMT-Cas9突变体的CG和CHG甲基化水平相比于WT显著下降,同时CHH甲基化水平发生变化。其中,CG甲基化变化主要发生在基因区域,CHG甲基化变化主要发生在转座子区域,而CHH甲基化变化大量分布于基因启动子区。5.综合分析DNA甲基化变化和基因表达水平变化,发现基因区域CG甲基化的丢失与部分光合作用和碳水化合物代谢相关基因的表达下降相关,而转座子区域的CG和CHG甲基化丢失与转座子相关基因的表达激活相关。结果表明褪黑素通过维持CG和CHG甲基化水平,促进光合作用相关基因表达,抑制转座子相关基因的表达,维护基因组的稳态,从而延缓叶片衰老。此外,CHH差异甲基化与部分衰老selleck产品相关基因(Senescence Associated Genes,SAGs)和转座子相关基因(TEGs)的表达变化相关,表明褪黑素可能通过调控这些区域的CHH甲基化调控SAGs的表达动态变化,从而影响叶片衰老过程。6.通过测定S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量,发现其水平在OsCOMT-Cas9突变体中显著低于WT,且其代谢途径相关基因表达水平在OsCOMT-Cas9突变体中的表达量相比于WT显著下降,而外源褪黑素处理能够显著回复这些基因的表达水平。通过外源SAM处理OsCOMT-Cas9突变体,其早衰表型和SAGs表达水平均获得了明显回复。结果表明褪黑素可能通过调节SAM的生物合成和代谢来影响DNA甲基化和基因表达水平。7.通过测定各株系不同时期的单株籽粒产量以及Groundwater remediation叶片光合作用指标,发现OsCOMT可以通过延缓叶片衰老和提高光合效率促进水稻籽粒产量提升,表明OsCOMT通过合成褪黑素调控叶片衰老的机制在水稻育种中具有重要的应用价值。综上,本研究发现OsCOMT-Cas9突变体由于内源褪黑素含量降低,在黑暗诱导条件下相较于WT提前衰老。转录组和DNA甲基化分析表明,褪黑素缺乏通过影响DNA甲基化稳态来调节光合作用和代谢相关基因的表达水平以及基因组稳定性。本研究从表观遗传学的新视角揭示了植物内源褪黑素的调控机制,并为水稻的遗传改良提供了新的参考依据。

目的 研究冠心康对脂多糖(LPS)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)干预的巨噬细胞铁死亡的影响及其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法 采用ox-LDL联合LPS诱导RAW264.7巨噬细胞D-Lin-MC3-DMA体外铁multidrug-resistant infection死亡并给予冠心康和ERK5抑制剂XMD8-92进行干预,检测铁死亡相关指标脂质过氧化物(LPO)含量、胞内二价铁离子(Fe~(2+))含量、活性氧(ROS)及谷胱甘肽(GSH)水平,IL-6、TNF-α、MMP含量及ERK5/Nrf2信号通路mRNA及蛋白的表达。结果 LPS联合ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞LPO含量、胞内Fe~(2+)含量及ROS水平升高,GSH含量减少,IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9含量显著升高,ERK5、Nrf2、HO-1、GPX-4的mRNA及P-ERK5、P-Nrf2、HO-1的蛋白表达水平降低(P<0.05)。冠心康组LPO、Fe~(2+)、ROS降低,GGSK1120212SH含量增加,IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9水平下调,ERK5、Nrf2、HO-1、GPX-4的mRNA及P-ERK5、P-Nrf2、HO-1的蛋白表达水平升高,而XMD8-92可以抑制冠心康这一作用(P<0.05)。结论 冠心康可以抑制LPS联合ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞的铁死亡,减轻炎症反应,其机制与活化ERK5及下游Nrf2通路有关。

甾体类药物具有抗过敏、消炎以及调节内分泌等作用,是世界上仅次于抗生素的第二大类药物,在制药工业中占据重要地位。从头全生物合成为甾体类药物的工业生产提供了新的思路,然而由于参与各个步骤的酶活性较低、合成过程复杂等问题,阻碍了甾体类药物全生物合成的工业应用。在整个甾体生物合成途径中,细胞色素P450酶CYP11A1s扮演了至关重要的角色,其负责催化胆固醇转化成重要的甾体类药物前体孕烯醇酮。然而,CYP11A1s较低的催化活性大大限制了其在甾体类药物微生物生产中的应用。因此有必要挖掘新的CYP11A1同工酶或者Unlinked biotic predictors对CYP11A1进行酶工程改造来提高其催化活性,以促进甾体类药物或甾体类药物前体的绿色生物合成。在本研究中,为了挖掘具有胆固醇侧链切割活性的CYP11A1s,对数据库中CYP11A1s进行生物信息学分析和基因组挖掘,并在大肠杆菌中进行异源表达以及催化活性检测。之后,对其中表达水平较高的几个CYP11A1s进行了包括底物特异性以及氧化还原伴侣适配性在内的生化表征。此外,基于已知的晶体结构对人源和牛源CYP11A1s进行半理性酶工程改造,期望获得高催化活性的胆固醇侧链切割酶。主要的研究内容和结论如下:1.不同脊椎动物来源CYP11A1s的异源表达基因组数据库中存在大量的CYP11A1基因有待挖掘。以牛源CYP11A1作为模板,在蛋白数据库中进行序列比对,利用同源序列构建了 CYP11A1s的系统发育进化树。基于系统发育树,从中挑选了包括7种哺乳动物、2种鸟类以及1种鱼类在内的10个不同脊椎动物来源的CYP11A1s在大肠杆菌中进行异源表达。通过检测细胞裂解液对于胆固醇的催化活性,在mChCYP11A1(山羊,m:mature)、mBtCYP11A1(牛)、mHsCYP11A1(人)、mSsCYP11A1(野猪)、mMmCYP11A1(鼠)和mTgCYP11A1(珍珠鸟)的体外酶反应产物中检测到了催化产物孕烯醇酮,实现了 6种不同来源CYP11A1的体外催化活性重建。2.不同来源CYP11A1s的生化表征在第一部分中获得的6种具有胆固醇催化活性的CYP11A1s中,选择表达水平较高的mChCYP11A1、mBtCYP11A1、mHMLN4924说明书sCYP11A1 以及mSsCYP11A1 进行生化表征。首先,对具有膜结合性质的这4种CYP11A1s进行了蛋白纯化和体外活性检测,成功获得了具有体外催化活性的纯蛋白。之后,利用纯化的4种CYP11A1蛋白,检测了其对胆固醇、链甾醇、谷甾醇、菜油甾醇以及7-脱氢胆固醇的体外催化活性,其中野猪来源的mSsCYP11A1展现出了较好的催化活性,且4种CYP11A1s均对底物7-脱氢胆固醇具有最高的催化活性。通过分子对接对底物特异性的原因进行了解释。此外,适配的氧化还原伴侣对于P450的催化活性至关重要。在大肠杆菌中对mChCYP11A1、mBtCYP11A1、mHsCYP11A1 以及mSsCYP11A1 的本源皮质铁氧还蛋白(Adx)以及皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)进行了异源表达,利用纯化得到的蛋白进行了氧化还原伴侣的组合筛选,催化活性比较结果表明来源于野猪的mSsAdx与来源于人的mHsAdR为最佳组合。3.CYP11A1的酶工程改造为了提高CYP11A1的催化活性,对其进行了酶工程改造。首先,通过序列比对发现在底物结合口袋6 A范围内共有3个差异氨基酸,研究了这3个差异氨基酸对CYP11A1催化活性的影响。之后,基于人源和牛源CYP11A1s的晶体结构,选择位于CYP11A1的活性位点以及底物入口通道的氨基酸残基进行了丙氨酸扫描,通过对突变体进行活性筛选获得了一个催化活性提高46%的突变体mBtCYP11A1-Q377A。此外,通过测量高催化活性突变体的底物入口通道直径,发现mBtCYP11A1-Q377A的底物入口拓宽了 34%,一定程度上解释了突变体催化活性提高的原因。获得的突变体mBtCYP11A1-Q377A为CYP11A1的工程改造提供了新的候选亲本酶,也为其他真核生物P450的改造提供了参考。综上所述,本研究通过基因组挖掘来寻找具有胆固醇侧链切割活性的CYP11A1s,成功实现了 6种不同来源CYP11A1s的体外活性重建。以人源和牛源CYP11A1s作为参考,对表达水平较高的山羊来源和野猪来源的CYP11A1s进行了生化表征,山羊来源的CYP11A1对所测试的底物展现出较好的催化活性,且所有4种CYP11A1s均对7-脱氢胆固醇具有最高的催化活性,最佳的氧化还原伴侣组合为野猪来源的Adx与人源AdR。通过对CYP11A1进行酶工程改造得到了一个催化活性提高的胆固醇侧链切割酶,这对CYP11A1的工程化改造具有指导性MAPK抑制剂意义,同时也为甾体类药物的微生物生产奠定了研究基础。

由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）是小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物的毁灭性病害。目前，生产上防治小麦赤霉病主要依靠化学药剂防治，多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂使用较为广泛，其作用靶标为β微管蛋白。禾谷镰刀菌有2个β微管蛋白，通过分子对接结果发现β2微管蛋白第138位氨基酸位点可能为多菌灵结合位点。本研究对β2第138位丝氨酸位点进行突变研究，以明晰其生物学功能。结果表明Fgβ2S138A突变后禾谷镰刀菌对多菌灵的敏感性显著增加，EC50值由0.617 mg/L降至0.290 mg/L，但不影响对噻菌灵的敏感性ICI 46474研究购买，EC50值为0.9BI 10773价格50 mg/L左右，并且该突变不影响禾谷镰刀菌菌丝营Urologic oncology养生长、无性繁殖、有性生殖和致病性。本研究结果可为多菌灵对小麦赤霉病的化学防治提供理论基础，在生产上具有一定指导意义。

基因治疗通过向靶细胞导入正常基因(外源)来治疗基因缺陷相关疾病。因此,基因治疗作为一种新的肿瘤治疗方式引起了研究者的关注。近年来,基于siRNA的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术迅速发展,该技术可以特异性降低或关闭目的基因的表达,因此该技术在基因治疗领域已经被大量应用。但是裸露的siRNA稳定性差、对血清降解敏感且难以穿透细胞膜。为此,研究者开发了各种各样的递送系统用于实现siRNA的高效递送。而基于聚合物的递送载体具有安全性高、结构易于改造等优势,是研究最多的一类siRNA递送载体。聚乙烯亚胺(PEI)可高效络合siRNA,其“质子海绵效应”可有效逃逸内涵体,但PEI具有显著的细胞毒性严重限制了其生物医学应用。聚乙二醇(PEG)化是一种广泛使用的提高递送系统生物相容性并延长其循环时间的策略,但该过程会降低细胞内化,这一现象被称为“PEG窘境”。Fe_3O_4纳米颗粒具有易于制备、尺寸小、易于化学功能化、优异的生物相容性和稳定性及良好的磁响应性等优势,在生物医学领域展现了良好的应用前景。基于以上研究背景,本课题设计并构建了www.selleck.cn/products/LBH-589一种PEG可脱落型磁性si PKM2纳米递送系统,该系统在弱酸性条件下可显著增强si PKM2的稳定性及递送效率,并可通过下调PKM2的表达来发挥抗肿瘤效应。本课题主要包括以下三个方面的研究内容。(1)PEG-PEI/Fe_3O_4复合物的合成与表征。首先合成PEG-PEI共聚物,然后与带负电荷的Fe_3O_4纳米颗粒通过静电相互作用provider-to-provider telemedicine形成PEG-PEI/Fe_3O_4复合物,通过TEM、SQUID、DLS等技术对其进行表征,证明了PEG-PEI/Fe_3O_4复合物被成功合成。接着通过荧光定量PCR技术、Western Blot技术在m RNA和蛋白水平证实:与结肠上皮细胞FHC相比,PKM2在结肠癌细胞HCT116中显著上调表达。因此,后续采用PKM2高表达的HCT116细胞作为研究对象进行实验。通过MTT法来检测PEG-PEI/Fe_3O_4复合物的细胞毒性,表明PEG的引入明显降低了PEI的细胞毒性。(2)PEG-PEI/Fe_3O_4复合物对siRNA的络合能力及递送效率研究。采用凝胶阻滞法检测了PEG-PEI及Telaglenastat供应商PEG-PEI/Fe_3O_4复合物对siRNA的络合能力,当N/P比大于等于5:1时,PEG-PEI共聚物及PEG-PEI/Fe_3O_4复合物与siRNA完全络合。琼脂糖凝胶电泳证明PEG-PEI/Fe_3O_4@siRNA复合物具有良好的血清稳定性。通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪检测了HCT116细胞对PEG-PEI/Fe_3O_4@siPKM2纳米复合物的摄取,结果表明在磁场引导和弱酸性条件下纳米复合物的内化能力明显增强,显著提高了siRNA的递送效率。另外,荧光定量PCR和Western Blot技术证实,在磁场引导和弱酸性条件下,PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物在m RNA和蛋白方面可有效抑制PKM2的表达。(3)PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物的体外抗肿瘤活性评价。通过MTT检测、结晶紫染色法、Annexin V-FITC/PI双染细胞调亡试剂盒、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、划痕法和Transwell实验等方法较为系统地研究了PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物的体外抗肿瘤活性。在p H 6.5并有磁场存在的条件下,PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物可有效抑制HCT116细胞的增殖并触发大量肿瘤细胞凋亡;再者,该纳米复合物可显著抑制HCT116细胞对葡萄糖的摄取并减少乳酸的产生,进而降低糖酵解水平;此外,PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物可高效抑制HCT116细胞的迁移。综上所述,本课题成功合成了PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物,该纳米复合物具有良好的血清稳定性;在肿瘤的弱酸性环境中,PEG会从纳米复合物上脱落下来,在磁场介导下有效进入肿瘤细胞,促进si PKM2高效递送,因此有望解决“PEG窘境”;PEG-PEI/Fe_3O_4@si PKM2纳米复合物通过下调PKM2的表达来发挥抗肿瘤活性。本研究可为p H和磁双响应型递送系统构建提供新策略,同时也可为代谢靶向型肿瘤治疗提供新思路。