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芬顿法作为一种高级氧化技术(AOPs),主要依靠强氧化性的自由基对有机污染物进行降解,因此设计合成催化活性高、稳定性好、节能环保的催化剂是解决水污染的关键。本文以钴铁普鲁士蓝类似物(PBAs)为出发点,进行H_2O_2改性和不同氛围的热处理,重点考察了各材料对亚甲基蓝(MB)的吸附能力和在各芬顿催化体系中对MB的降解能力。主要研究内容如下:1)采用水热合成法制备钴铁普鲁士蓝类似物,对柠檬酸钠(TSCD)含量、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)添加量、水热温度和水热确认细节时间进行了调控。通过XRD、TEM表征和性能测试确定TSCD=0.1250 mmol·L~(-1),120℃水热反应24 h时为最佳制备条件,成功制备出了Co-PBA-0。Co-PBA-0的优势晶面为(2 2 0),呈多面体形貌,在50 min内可达到68%的MB脱色率。2)以Co-PBA-0为前驱体,利用30%H_hepatitis-B virus2O_2改性处理30 min得到Co-PBA-30。该材料在20 min就能达到99%的MB脱色率,活化能为30.23 k J·mol~(-1)。通过各表征手段对比分析H_2O_2改性前后材料理化性质的变化,结果显示H_2O_2处理后,Co(II)的占比增多。另外,还对其性能测试的影响因素进行了探究,最后通过电子顺磁共振(EPR)自由基检测和自由基猝灭实验,验证了Co-PBA-30催化H_2O_2氧化的主要活性物种为·OH,并推测了MB的降解途径。3)以Co-PBA-0为自牺牲模板,对其进行空气、N_2和Ar氛围的热处理,并探究了不同温度产物理化性质和性能的变化。其中,空气煅烧生成了金属氧化物,但烧结现象影响了材料的性能。而N_2和Ar氛围在610℃高温煅烧均成功制备出了核壳结构的氮掺杂碳层包覆Co Fe合金,显示出了极高的CL13900使用方法吸附和催化性能。特别是N_2氛围610℃煅烧产物N_2-610在30 min内就能达到95%的MB脱色率,四次循环后仍保持90%的脱色率。通过EPR检测和自由基猝灭实验,证明了催化H_2O_2氧化的主要活性物种为·OH,并推测了MB的降解途径。

在肿瘤治疗中,单一疗法往往具有局限性,治疗疗效与结果也不尽人意。将化疗、放疗、手术、生物治疗等疗法联合使用,可起到协同抗癌效果,延缓肿瘤生长,增强抗癌作用的同时降低毒副作用。其中,化疗和免疫疗法的联合是一种常见联合治疗策略,二者可以起到相互促进的协同抗癌作用。然而,小分子化疗药物和免疫治疗的基因药物在复杂的生理环境内面临多重屏障,极易被水解或清除,很难靶向到达肿瘤部位,且多数化疗药物具有较大的毒副作用。因此,将智能纳米递送系统用于联合治疗增强疗效与抗肿瘤作用具有重要的研究意义和临床应用价值。纳米颗粒进入人体后,会面临多重生物屏障,如何针对不同阶段生理障碍的特性设计出高效低毒且靶向性强的纳米递送系统仍然面临着巨大挑战。本论文构建了基于血液、肿瘤组织以及细胞递送阶段具备不同特性的纳米纳米递送系统(HA/P-A cluster),共载化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)和免疫阻断抑制剂(p PD-L1 trap)。该纳米集簇初始尺寸约为180 nm,能够避免药物在血液中被清除,同时延长药物体内半衰期;达到肿瘤组织后,纳米集簇被肿瘤组织中高表达的金属机制蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)裂解为尺寸约为10 nm的小粒径纳米颗粒,増强药物在肿瘤组织中的渗透并且促进肿瘤细胞摄取DOX和p PD-L1 trap质粒。在肿瘤细胞中,纳米颗粒能够快速释放药物,DOX作用于癌细胞的DNA,将冷肿瘤转换为热肿瘤,诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡(Immunogenic cell death,ICD)并释放损伤分子相关模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs);p PD-L1 trap指导肿瘤细胞原位表达PD-L1 trap蛋白,该蛋白阻断PD-1/PD-L1通路,有效减轻PD-1+T细胞的免疫抑制状态,同时减少自身免疫症状的发生;二者联合使用,通过靶向递送到肿瘤部位,在诱导肿瘤细胞发生ICD的同时阻断PD-L1通路,杀灭肿瘤细胞并激活机体抗肿瘤免疫,起到“1+1>2”的协同抗癌作用。在第一章,制备了HA/P-A cluster纳米集簇并对其进行表征,对该纳米集簇的相关理化性质进行检测。首先,将DOX物理包封于小粒径阳离子聚合物PAMAM的疏水空腔内,通过调节二者的比例得到粒径为10 nm,带正电,购买MLN8237分散性好且载药率为23.53%的小尺寸纳米颗粒PAMAM@DOX。随后,通过层层自组装法获得纳米金PEI复合物(Au PEI),该纳米颗粒粒径约为8 nm,带正电。通过静电吸附将免疫治疗的基因药物p PD-L1 trap质粒负载于Au PEI表面得到Au-p PD-L1 trap,其粒径仍为8 nm。最后,以SMCC作为交联剂,通过MMP敏感的双功能肽R14将两种小粒径纳米颗粒交联为立体网状纳米集簇,用透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对纳米集簇进行包覆得到粒径为180 nm,带负电的纳米集簇(HA/P-A cluster)。HA/P-A cluster在低p H下可以缓释化疗药物DOX,且其粒径在体外7天内无明显变化,较为稳定。此外,该纳米集簇能够有效缩合DNA,且溶血率在实biological nano-curcumin验涉及的浓度下小于5%,安全性良好。在第二章中,对纳米集簇的体外体外抗肿瘤效果与生物学作用进行研究。首先通过流式细胞术与共聚焦显微镜,考察了纳米集簇的细胞摄取,对比游离p PD-L1trap与DOX,纳米集簇的细胞摄取量明显增多。通过MTT法与凋亡试剂盒评价纳米集簇诱导肿瘤细胞凋亡的能力,结果显示,纳米集簇可以有效诱导B16-F10细胞凋亡,细胞毒性与凋亡结果趋势一致。为了验证纳米集簇诱导肿瘤细胞发生ICD的能力,检测纳米集簇处理细胞后ICD标志分子钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和热休克蛋白(Heat shock protein 90,HSP 90)的表达,流式细胞术与免疫荧光法结果均显示,纳米集簇可以诱导肿瘤细胞高表达CRT和HSP 90,这表明纳米集簇可以高效诱导肿瘤细胞发生ICD。采用ELISA和化学发光法分别检测纳米集簇处理后肿瘤细胞高迁移率族蛋白HMGB1和ATP的释放,结果显示,纳米集簇处理后小鼠黑色素瘤细胞B16-F10释放到胞外的HMGB1和ATP含量大幅增加。此外,HA/P-A cluster还可以诱导B16-F10细胞表面MHC-I的表达,这意味着纳米集簇不仅可以诱发ICD,还能诱导细胞识别和呈递内源性抗原肽。最后,以GFP作为报告基因验证纳米集簇的体外基因转染效率,结果显示,纳米集簇的转染效率随着质量比的增加呈现先增加后减小的趋势,在30:1达到最佳。使用His标记的ELISA试剂盒检测这一比例下纳米集簇对p PD-L1 trap的转染效率,结果表示HA/P-A cluster可以有效转染p PD-L1 trap,诱导细胞表达PD-L1 trap蛋白,且随着纳米颗粒作用时间的延长,PD-L1 trap蛋白的累积释放量显著增加。在第三章中,首先构建了B16-F10细胞的小鼠荷瘤模型。定期记录治疗期间小鼠肿瘤体积和体重的变化,治疗结束三天后,处死小鼠并切除肿瘤组织与主要器官进行检测。结果显示HA/P-A cluster治疗可以有效延缓肿瘤生长,该组小鼠肿瘤体积小,瘤重轻,细胞凋亡数量多,抗癌效果显著。通过H&E染色验证了纳米集簇的生物安全性,HA/P-A cluster对小鼠主要器官无毒副作用,治疗期间小鼠体重变化不明显。通过免疫荧光法与流式细胞术对肿瘤组织进一步分析发现,纳米集簇的治疗增加了肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润,进一步印证了纳米集簇有效激活了机体的抗肿瘤免疫。综上,本课题构建了一种肿瘤微环境响应型纳米集簇,外包裹的HA增加了纳米集簇的稳定性,有助于纳米集簇实现体内长循环,此外,HA还与肿瘤细胞表面高表达的CD44相互作用进而主动靶向至肿瘤部位。HA/P-A cluster(180 nm)蓄积于肿瘤部位后,纳米集簇被MMP水解为两种粒径约为10 nm的小颗粒(PAMAM@DOX和Au-p PD-L1 trap)并经R14靶向介导进入肿瘤细胞。随后,纳米集簇负载的化疗药物DOX与免疫治疗基因药物PD-L1 trap在肿瘤细胞内发挥协同抗肿瘤作用。体内和体外实验结selleck Emricasan果都表明,纳米集簇可以有效诱导肿瘤细胞凋亡,延缓肿瘤生长,增加肿瘤部位CD8+T细胞的浸润,激活机体抗肿瘤免疫,通过协同效应增强癌症治疗效果,为设计和研发基于尺寸可变的纳米集簇提供技术路径,也为提升化学免疫治疗在抗肿瘤中的应用提供策略。

结合高温低压处理、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶复合酶解制备具有高钙结合能力的卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin phosphopeptides,PPP)。通过优化确定制备PPP-Ca的最佳条件为pH 9.5,多肽与钙质量比7∶1,此条件下钙螯合率达到97%,PPP-Ca在模拟胃肠道消化中显示了极高的稳定性。使用Caco-2细胞单层模型验证PPP-Ca在体外的钙转运作用,通过细胞形态、电阻值和荧光素钠透过率等验证Caco-2细胞模型,毒性实验(MTT)结果显示PPP-Ca对Caco-2细胞呈现低毒性作用。研究PPP-Ca和PPP对Caco-2细胞转运钙离子质量浓度和碱性磷酸酶(alkaliAzo dye remediationne phosphatase,AKP)活性的影响,采用RT-PCR测定Calbindin D9K mRNA的相对表达量。结果表明,PPP和PPP-Ca能够显著提高AKP活性,钙转运量从(3.06MK-1775溶解度±0.08)μg增selleck到(5.66±0.62)μg,Calbindin D9K mRNA的表达量增加2倍,进而增强人体肠道中钙的转运吸收。研究结果为开发新的钙补充剂和卵黄高磷蛋白提供了科学证据。

开花是植物生长过程中由营养生长向生殖生长转变的重要过程。植物开花过程受到环境和内源因素等多重影响,因此植物进化出一系列分子机制调控开花时间。适宜的开花时间有利于植物繁殖后代,对于作物而言,开花过程与作物产量息息相关。小麦作为世界主要粮食作物之一,解析其开花机制有利于人们更好的调控开花时间,规避自然灾害从而提高作物产量。然而小麦基因组庞大复杂,生长周期时间长,加大了研究难度。二穗短柄草与小麦同属温带禾本科植物,其基因组小,生长周期短,是研究小麦的模式植物。本研究以二穗短柄草为主要实验材料,MYB转录因子为主要研究对象,探究光周期途径调控温带禾本科植物开花的分子机制,取得的研究结果如下:1.MYB11具有节律表达模式且长日照下负调控开花通过q RT-PCR,发现MYB11在长日照下高水平表达,随着光照时间增加表达量逐渐积累,在ZT16(Zeitgeber time 16)出现表达峰值,具有明显的昼夜节律,并且其表达水平依赖于光敏色素PHYC。在二穗短柄草myb11突变体中观察开花表型,发现其在长日照下出现极早花表型,短日照下则开花时间无明显差异;长日照条件下,开花途径关键基因CO1(CONSTANT1)、FT1(FLOWERING LOCUS T1)、FUL2(FRUIThttps://www.selleck.cn/products/cobimetinib-gdc-0973-rg7420.htmlFULL2)和VRN1(VERNALIZATION1)在myb11突变体中表达量均显著高于野生型。此外,FT1启动子上存在多个MYB转录因子结合位点;烟草瞬时表达实验结果显示MYB11通过P＿C结构域结合并抑制FT1启动子活性,从而实现负调控开花。2.MYB11Familial Mediterraean Fever参与调控类黄酮合成通过与拟南芥R2R3-MYB构建系统进化树,发现MYB11属于SG7亚组,且在二穗短柄草中仅存在单一拷贝;转录组分析发现,与野生型相比,myb11突变体参与光合作用和代谢过程中的多个基因表达水平发生显著变化;利用q RTPCR检测发现,类黄酮合成相关基因PAL1(Phenylalanine anunonialyase 1)、TT4(TRANSPARENT TESTA 4)、CHI(Chaleone isomerase)表达水平较野生型显著下调,表明MYB11可能是参与类黄酮合成调控的重要因子。3.小麦MYB11在营养组织中高水平表达通过蛋白序列比对,在小麦数据库IWGSC中获得了10个二穗短柄草MYB11的同源基因,其中3个基因(Traes CBYL719S4A02G118400、Traes CS4B02G186000、Traes CS4D02G187100)序列与短柄草MYB11最为相近,为其直系同源基因。时空表达分析发现它们在小麦生长过程的苗期和分蘖期大量表达,猜测其可能对于小麦由营养生长向生殖生长时期的转变过程具有一定的调控作用。综上,本研究在二穗短柄草中发现了一个受光周期调控表达R2R3-MYB转录因子MYB11,并初步阐明了其在光周期开花途径和类黄酮合成中的作用,同时在小麦中鉴定了MYB11的同源基因并进行了时空表达分析。这些研究结果不仅可为解析小麦光周期开花调控途径提供新思路,也可为小麦抽穗期农艺性状改良提供启示。

目的 探讨灰色小克银汉霉感染导致成人毛霉菌病患者的临床特点及诊治方案。方法 总结某院血液内科收治的1例灰色小克银汉霉感染致成人侵袭性毛霉菌病患者的临床诊疗过程，并检索数据库相关文献进行复习。结果 患者男性，54岁，因“反复乏力1年余，加重伴发热1周”入院，肺组织病理检查可见宽大MLN4924纯度、不规则、无分隔的菌丝，形态学鉴定为毛霉菌，肺泡灌洗液及外周血宏基因组二代测序(mNGS)检测示灰色小克银汉霉，诊断为灰色小克银汉霉感染致侵袭性毛霉菌病，给予脂质体两性霉素B联合泊沙康唑、卡泊芬净治疗后感染获得控制。检索出符合条件的文献37篇，加上本病例，共纳入44例患者，其中男性26例，女性18例，中位年龄52.5(18～79)岁；基础疾病主要为血液系统疾病(65.9%,29例),进行造血干细胞或实体器官移植者14例；最常见的侵犯部位为肺、脑及皮肤，分别HDAC抑制剂为36、9、9例；组织病理学、真菌培养、直接镜检及分子学检测阳性者分别为28、37、29、17例。41例患者接受了抗真菌治疗，其中8例联合手术治疗；30例死亡，病死率为68.2%,抗真菌治疗联合手术者生存率(62.5%,5/8)高于单独抗真菌治疗者(24.2%,7/33)。结论 灰色小克银汉霉感染所致成人毛霉菌病在血液系统疾病患者中最常见，造血干细胞或实体脏器移植为高危因素，常见感染部位为肺部，并可侵犯全身多脏器，病死率高，病原学诊断十分Next Gen Sequencing重要，抗真菌联合手术治疗可提高生存率。

苦荞(Fagopyrum tataricum)作为荞麦属重要的药用作物,因富含有益于人体健康的类黄酮化合物而成为当前研究的热点。花色苷和原花青素是苦荞中重要的类黄酮化合物,参与植物的色素沉着及抵御胁迫,对人畜健康益处颇丰。其生物合成受到转录水平的调控,然而对于bHLH转录因子参与苦荞花色苷和原花青素合成的调控机理知之甚少,因此研究苦荞花色苷和原花青素合成的调控机理对于完善苦荞花色苷和原花青素合成调控网络具有重要的价值,为培育高品质的苦荞品种提供重要的理论依据。本研究基于拟南芥bHLH家族成员中正调控花色苷和原花青素生物合成的At TT8蛋白序列,利用苦荞数据库检索出其同源蛋白。然后以‘晋荞2号’为实验材料,克隆相应基因并进行序列分析、组织特性表达分析、系统进化分析以及亚细胞定位和转录激活实验。同时,构建过表达载体(p MDC83::FtTT8),转化拟南芥突变体attt8和红花烟草K326以验证FtTT8转录因子的功能,通过酵母单杂技术验证FtTT8与靶标基因的互作研究。主要结果如下:(1)从苦荞基因组数据中筛选到拟南芥At TT8的同源蛋白Ft Pin G0008212200.01.T02。从‘晋荞2号’芽菜中成功克隆到完整的CDS序列,命名为FtTT8。测序比对结果显示其与Ft Pin G0008212200.01.T02转录本序列完全一致,其开放阅读框全长为2199 bp,编码732个氨基酸,预估该蛋白的分子量为80.52Empagliflozin分子式9 KDa。(2)FtTT8与其他物种中具有调控花色苷和原花青素合成的bHLH转录因子进行多序列比对,结果表明FtTT8具有典型的bHLH结构特征,即保守的MIR、bHLH及ACT-like结构域。系统发育分析表明FtTT8与枫香Lf TT8的亲缘关系最近,且聚为同一分支的成员含有相似的基序。(3)共表达分析表明FtTT8与大多数花色苷和原花青素合成结构基因具有相似的表达模式,即在不同组织均有表达且叶中积累量最高,结果暗示FtTT8转录因子可能参与调控这些结构基因的转录表达进而影响花色苷或原花青素的合成。拟南芥原生质体转化实验和酵母双杂交实验结果表明FtTT8是一个在细胞核中表达的转录激活因子,行使转录因子的功能。(4)拟南芥遗传转化实验表明FtTT8异源过表达拟南芥attt8突变体后能抑制花色苷的积累促进原花青素的合成。幼苗表型观察表明FtTT8回补拟南芥tt8突变体(35S:FtTT8)、attt8突变体(tt8)与野生型(WT)相比无明显花色苷积累,叶片经DMACA染色后35S:FtTT8系和WT叶片出现较少的蓝色斑点;其花色苷含量测定表明35S:FtTT8系相比WT极显著下调花色苷的积累,与tt8突变体无显著差异;此外原花青素含量测定表明35S:FtTT8系相比tt8突变体显著上调原花青素的积累且WT的原花青素积累量显著高于tt8突变体和35S:FtTT8。q RT-PCR分析表明35S:FtTT8系相比tt8突变体显著上调花色苷和原花青素合成基因的表达,35S:FtTT8系与野生型相比,极显著抑制DFR、ANS及UFGT的表达,而极显著上调CHS、F3H的转录水平,上调CHI及ANR的表达,抑制花色苷合成促进原花青素得积累,这与表型观察和生理检测结果相吻合。种子中表型观察结果表明35S:FtTT8系使淡黄色种子表型恢复至野生型颜色,且经DMACA染色后与tt8黄色种子相比,35S:FtTT8系和WT种子均被染成蓝紫色;其相对应的原花青素含量测定表明35S:FtTT8系原花青素含量约是WT的1.8倍,tt8的5.3倍,由此可见FtTT8显著提高了原花青素的积累;q RT-PCR分析相关基因转录水平结果表明35S:FtTT8系极显著上调tt8突变体中CHI、F3H和ANR的转录表达,上调Bio-inspired computingDFR、ANS的表达,35S:FtTT8株系相比野生型,极显著上调DFR的表达,上调ANR基因表达,促进原花青素的合成,这与表型观察和生理检测结果相一致。(5)烟草遗传转化实验表明FtTT8异源过表达野生型K326红花烟草抑制花色苷的合成且促进原花青素的积累。烟草花表型观察结果表明烟草过表达FtTT8系(OE-FtTT8)中相比野生型花的颜色明显变浅,经DMACA染色后两者无明显差异。其花色苷含量测定结果表明以WT为对照,OE-FtTT8系中的花色苷积累量显著下降;而原花青素含量测定结果表明OE-FtTT8系与WT无显著差异。相关基因转录水平分析结果表明以WT对照相比,OE-FtTT8系极显著上调了F3’H和DFR的转录水平,而其他合成基因均被显著下调。OEFtTT8系烟草叶片与WT相比无明显颜色差异,经DMACA染色后OE-FtTT8系能明显看出深蓝色斑点且富集程度较WT密集,此外花色苷含量测定结果表明OE-FtTT8中的花色苷积累水平显著低于WT,而原花青素的含量显著高于WT,结果表明OE-FtTT8中的原花青素含量约是WT的2.8倍。q RT-PCR结果表明OE-FtTT8与WT对照相比,除UFGT基因极显著下调和ANR基因无显著差异表达外,其他合成相关基因的转录水平极显著上调,如LAR、ANS、DFR等增幅最为明显,由此说明异源过表达FtTT8抑制烟草花色苷的积累,促进原花青素合成。ICI 46474分子量(6)酵母单杂交实验表明FtTT8分别与原花青素合成关键酶基因At ANR及花色苷合成转运基因At UFGT的启动子结合,可能激活它们的表达从而参与调控拟南芥花色苷和原花青素合成,但其具体调控机理还需深入研究。综上所述,初步探索了FtTT8参与调控拟南芥和烟草花色苷和原花青素合成通路,为苦荞花色苷和原花青素合成的分子调控网络提供了理论依据。

本项目选择了精神病学家艾伦·沃拉的《解析焦虑:理解和克服身体的恐惧反应》的引言以及前四章作为本翻译实践报告的源文本。该书主要从身体和心理两方面介绍了焦虑的表现形式,并告诉我们应该如何克服焦虑。在翻译的过程中,译者遇到了一些困难,比如专业词汇、心理学术语的翻译,如何处理逻辑关系不明确,指代不清等。这些难点如果处理不当,会给读者的阅读理解带来困难。鉴于此,本报告选取了明晰化的翻译策略,探讨该策略在源文本汉译中的应用。明晰化的概念最早由法国学者维奈(J.P.Vinay)和达贝尔内(J.Darbelnet)于1958年提出。明晰化是翻译过程中的一种常见策略,能够将原文中由语言和文化差异造成的隐含信息明确地表达出来,让译文更加通顺自然、更容易理解。同时,明晰化考虑目标读者的接受,强调译文应该符合目标语言的文体偏好,避免不地道的表达,有利于提高心理学文Cerebrospinal fluid biomarkers本的可读性。克劳迪将Staurosporine生产商明晰化分为强制性明晰化,选择性明晰化,语用明晰化以及翻译内E-616452体外在明晰化。对于翻译内在明晰化,克劳迪没有给出具体的例子,因此文中未对这一分类进行讨论。对于时态、指代以及长难句的翻译问题,译者通过明确时态,明确指代,以及句式拆分与重组实现了强制性明晰化。对于逻辑关系模糊,句式转变,词性转变的问题,译者通过明确逻辑关系,转变句式,改变词性的技巧来实现选择性明晰化。对于含有英语文化背景的表达以及专业词汇和术语的翻译,译者通过释义,增译以及添加注释实现语用明晰化。通过翻译和分析,本研究发现,明晰化策略能使原文中的信息更加直白易懂,译文更加流畅,符合目的语的表达习惯,有助于读者理解文意,适合心理学文本。译者在翻译这类文本时,应根据明晰化类型确定必须或应该明晰的信息,再根据文本特点采用具体的翻译技巧,使译文清楚,易于理解,最大程度上服务于目标读者。

水稻作为全球主要粮食作物之一,其产量和品质仍受病虫害和环境因素等限制,难以突破瓶颈。鉴定抗性基因,培育高产抗性水稻品种将有助于解决这一难题。通过对滞绿ABT-199基因的研究发现,一些农作物滞绿特性的出现不仅可延缓植株衰老,还会提高育种效率。但对滞绿基因参与调控植物抗病性的研究还较少。基于对实验室前期获得的T-DNA插入水稻突变体库进行研究,获得一个常绿突变体des1(Delated senescence 1),其表型主要体现在苗期60d后植株高度略高于野生型,籽粒成熟后期叶片滞绿现象明显且延缓衰老。在抽穗期后,突变体des1与野生型爱知旭相比叶绿素含量降解速度缓慢,qRT-PCR分析显示其衰老相关基因显著下调表达。另外,与野生型相比,突变体des1结实率和千粒重略有下降。病原菌接种试验表明突变体des1对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。qRT-PCR结果显示,抗病相关基因表达量均显著升高。突变体des1叶片黑暗诱导的衰老延迟,对外源激素MeJA、GSK1120212溶解度ABA的敏感性降低,且MeJA、ABA相关途径基因表达量下调。通过Sitefinding-PCR的方法获得了突变体des1插入位点的侧翼序列,克隆并确认了T-DNA插入位点影响的基因OsDes1。RT-PCR和qRT-PCR结果表明,T-DNA插入致使OsDes1基因表达量上调hepatocyte differentiation。且OsDes1基因受稻瘟菌、外源MeJA、ABA诱导表达。遗传转化获得OsDes1基因超表达及敲除转基因植株。测量超表达植株叶绿素含量,发现其叶绿素降解速度慢于野生型,黑暗诱导植株滞绿性较野生型显著。接种稻瘟菌发现,超表达植株同样增强了对稻瘟病的抗性,并伴随着抗病相关基因的显著上调表达。而敲除植株与野生型无明显表型差异。后续将对OsDes1的分子功能进行研究,以期明确OsDes1在植物滞绿和抗病中的作用。

【目的】基因治疗作为一种很有前途的新兴技术,可以治疗许多复杂性疾病,开发安全有效的核酸递送载体是实现基因治疗的关键。聚乙烯亚胺PEI是研究最广的阳离子基因载体,其转染效率与分子量成正比,然而高分子量的PEI具有较高的细胞毒性,很大程度上限制了它的应用。壳聚糖因具有较好的生物相容性也可作为基因治疗的载体,然而单独的壳聚糖溶解性差、转染效率低。本研究以低分子量的PEI(PEI_(600))、和β-环糊精(β-CyD)作为骨架,修饰羧甲基壳聚糖CMCS,合成了一种新型的基因纳米载体CMCS-PEI_(600)-CyD,并在细胞水平对其作为基因载体和免疫治疗中的应用进行了研究。【方法】1.利用化学合成方法依次对壳聚糖进行解聚和羧甲基化得到羧甲基壳聚糖CMCS,合成纳米载体PEI-CyD,将PEI-CyD与CMCS耦合形成CMCS-PEI_(600biomimetic robotics)-CyD纳米载体;2.利用静电作用制备CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,考察复合物的形态、粒径大小、表面电荷以及对DNA的包裹能力;3.以EGFP绿色蛋白为报告基因,比较在人肾上皮细胞系293T和人树突状细胞h DCS上,不同质量比及不同载体的转染效果;4.以萤火虫荧光素酶p Luc为报告基因,定量检测不同载体在人肾上皮细胞系293T和人树突状细胞h DCS上的转染效率;5.利用CCK-8实验检测不同载体对人肾上皮细胞系293T及小鼠骨髓来源树突状细胞DC2.4的细胞毒性;6.在DC2.4细胞中转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,通过q PCR检测IL-10、ILselleck Belumosudil-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子在m RNA水平的表达;7.在DC2.4细胞中转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,利用ELISA技术检测纳米复合物转染后细胞上清液中的IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β等细胞因子蛋白的表达;8.DC2.4细胞转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物后,流式细胞术检测DC2.4细胞表面分子(如CD80、CD86、MHCⅡ类分子)的表达,以此作为细胞成熟的标志。【结果】1.透射电镜发现,CMCS-PEI_(600)-CyD纳米载体(简称CPC)可以将DNA很好的包裹成球形粒子;纳米复合物CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA的粒径约为118 nm,表面电荷为23 m V左右;琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米复合物CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA在质量比为0.5:1时,CPC可将质粒DNA完全包裹;2.细胞转染实验发现,当质量比为20:1时,CPC/p GFP纳米复合物达到最佳转染效率;3.定量实验证明,当质量比为20:1时,CPC/p Luc在293T细胞和h DC细胞上均具有最佳转染效率,且转染效率优于羧甲基壳聚糖CMCS、PEI_(600)、PEI-CyD;4.采用CCK-8法测定CMCS-PEI_(60selleck ABT-2630)-CyD/pDNA纳米复合物293T和DC2.4的细胞活力,结果发现纳米载体CPC具有较低的细胞毒性;5.CMCS-PEI_(600)-CyD/pluc纳米复合物转染后,促进了m RNA水平IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子的表达;6.CMCS-PEI_(600)-CyD/pluc纳米复合物转染后,促进免疫因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β及DC2.4表面分子CD80、CD86、MHCⅡ的上调,进而促进了细胞的成熟。【结论】本课题构建的纳米载体CMCS-PEI_(600)-CyD,是一种高转染效率且低毒性的新型载体,该载体在人肾上皮293T细胞和人树突状h DCS细胞上可以促进基因的高效转染,该载体还可促进免疫因子及DC细胞的成熟,发挥潜在的免疫激活作用。

3-羟基丁酮(Acetoin,AC)是微生物糖代谢途径的溢流代谢主要产物之一,具有3R-AC和3S-AC两种旋光异构体,并且在医药和化工合成方面具有很高的市场价值Others抑制剂和重要的工业意义。微生物发酵3-羟基丁酮过程中常常伴随有副产物2,3-丁二醇(Butanediol,BD)的生成。课题前期为了提高B.subtilis3-羟基丁酮的产量删除了其与2,3-丁二醇合成相关的丁二醇脱氢酶(Butanediol dehydrogenase,BDH)编码基因bdhA,但在bdhA缺失菌株中依然检测到内消旋丁二醇(meso-BD)的积累。同时,还发现bdhA缺失菌株产AC的两种旋光异构体比值发生较大变化,3S-AC量大幅减少。因此,本论文围绕B.subtilis发酵AC过程中meso-BD的来源以及3S-ACICI 46474的减少两方面入手,通过对菌株发酵行为分析、新的BDH基因的挖掘、验证,bdhA基因编码蛋白催化特性开展研究工作,主要研究结果如下:(1)通过文献挖掘和生物信息学分析在B.subtilis 168基因组中找到一条可能与meso-BD合成相关的目标序列(将其命名为bdhB),其在NCBI中的登录号为NP_389260.1,被注释为氧化还原酶,长度为747bp,与以Bacillus sp.101菌株中meso-BDH基因同源性为98%。该基因序列编码蛋白质理论分子量为26.2KDa,不存在跨膜区、信号肽,为非分泌蛋白。该序列中包含adh_short_C2结构域(Accession:PF13561)、细胞壁合成蛋白CwsA家族(PF10814)和短链脱氢酶结构域(Accession:c135484)。本文首先采用基因敲除方式验证bdhB基因的功能,但通过各种条件的转化尝试,始终没有获得bdhB基因敲除转化子。根据对基因氨基酸序列预测,推测该酶可能与细胞分裂和细胞形态维持有关,敲除该基因后可能会导致细胞死亡。因此,本文又采用qRT-PCR技术,通过分析了原始菌株和bdhA缺失菌株中bdhB基因的在不同发酵周期表达量差异,结合菌株发酵行为,发现在相同培养时间下,bdhA缺失菌株中bdhB基因的表达量与meso-BD产量呈正相关关系,初步判定bdhB基因与meso-BD合成有相关性。(2)成功构建了bdhA基因的枯草芽孢杆菌分泌型表达载体pHT43-bdhA和大肠杆菌的pET28a-bdhA、pGEX-bdhA表达载体。采用枯草芽孢杆菌pHT43-bdhA表达,采用硫酸铵沉淀等常规酶蛋白纯化方法,沉淀中没有检测到目标蛋白条带,分析原因可能是bdhA在枯草中表达量偏低。使用大肠杆菌pET28a表达载体表达(纯化标签为组氨酸标签(His-Tag)),蛋白纯化效果不理想。使用大肠杆菌pGEX-bdhA表达载体(纯化标签为GST标签),成功获得了 R-BDH蛋白。分别以3-羟基丁酮和2,3-丁二醇为底物检测了R-BDH的催化特性,结果表明R-BDH不仅能够催化3R-AC和(2R,3R)-2,3-BD之间相互转化,也能够催化3S-AC和meso-2,3-BD相互转化。(3)基于GenB ank、Brenda、Uniprot等数据库搜集了不同来源和底物特性的BDH序列,采用生物信息学手段比较了序列同源性及蛋白质结构。发现不同来源的R-BDH亲intermedia performance缘关系较近,而meso-BDH、S-BDH与DAR分类特征不明显,DAR也可能属于meso-BDH或S-BDH的一种。结构域分析显示R-BDH含有乙醇脱氢酶GroES样结构域和锌结合脱氢酶结构域,S-BDH、meso-BDH和DAR都有一个短链脱氢酶结构域、烯酰基-(酰基载体蛋白)还原酶结构域和一个酮基还原酶结构域。(4)基于对B.subtilis菌株168和168D的发酵产物中AC和BD不同旋光异构体含量变化以及其体内两种BDH催化特征,基本可以推定B.subtilis168发酵液中3S-AC是由3R-AC通过双酶(R-BDH和meso-BDH)催化转化而成。