Author: admin

目的 ：探究姜黄素对大鼠睾丸缺血再灌注损伤后的保护作用及核因子E2相关因子2(Nrf2)表达的影响。方法 ：32只4周龄健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、姜黄素单次给药组（术中灌注姜黄素）、姜黄素连续给药组（术中及术后7 d灌注姜黄素），每组8只。建立左侧睾丸扭转复位动物模型，于缺血再灌注损伤后1周用彩色多普勒超声观察睾丸损伤情Pexidartinib小鼠况；术后6周处死大鼠，取左侧睾丸，测量精子活动率及精子计数；睾丸组织切片H-E染色观察睾丸组织病理改变；qRT-PCR检测各组大鼠睾丸Nrf2表达的差异。结果 ：姜黄素给药组能明显提高大鼠睾丸缺血再灌注损伤后精子活动率、精子计数水平，且能显Aeromedical evacuation著改善睾丸组织损害程度。姜黄素给药组睾丸Nrf2的表达水平明显高于缺血再灌注损伤组。结论 ：姜黄素能够上调缺血再灌注损伤后睾丸Nrf2的表达，有效减轻睾丸缺血再灌注损伤，从而对青春前期大鼠单侧睾丸扭转起到明显的远期LY-188011保护作用，且连续给药优于单次给药。

随着国际竞争的加剧,新的挑战和机遇不断充斥着各个行业,教育也不例外,在经KPT-330采购济、科技的迅猛发展和社会的深刻变革之下,我国对提高国民素质和人才培养质量提出了新要求,核心素养成为当下教育教学的核心内容。至此,以学生、学生的学习和学习效果为中心的课程教学体系逐渐发展成为指导我国教育改革走向的先进教学理念。我国于2001年颁布《基础教育课程改革纲要(试行)》,开始具有划时代意义的新一轮课程改革。课程体系和教育观念的更新,促使我国从传统的基于教材或教师经验的课程转向基于课程标准的教学。《普通高中生物学课程标准(2017年版于2020年修订)》(下文简称《新课标》)结合生物学的学科本质,提出了生命观念、科学思维、Image-guided biopsy科学探究和社会责任四个方面的NSC125066细胞培养生物学学科核心素养。其中,生命观念作为生物学四个学科核心素养中的标志和关键,对凝念碎片化知识、解决实际问题至关重要。逆向教学设计作为基于课程标准的教学设计模式,以实现“教—学—评”一体化为目的,强调评价的设计先于教学活动,评价与教学融合,为教师落实《新课标》基本理念,培养学生生物学核心素养提供了有效途径。上述背景之下,本研究基于生命观念进行逆向教学设计与实践研究,以期通过“生物学事实—概念—观念”的生命观念培养路径,结合多种教学策略与多元评价方式,培养学生掌握科学的学习方法,提高课堂参与度,发展并形成生命观念。研究内容如下:(1)采用文献研究法,对生命观念及逆向教学设计等相关理论及研究成果进行文献梳理,总结国内外研究现状,提出问题,明确研究目的和意义;(2)采用问卷调查法,编制和发放调查问卷,摸清教师对生命观念的培养和逆向教学设计的认知现状,掌握学生生命观念学习方式等情况;(3)采用实践研究法,基于逆向教学设计理念,深入挖掘人教版高中生物学教材必修2《遗传与进化》第三章与第四章的内容,结合单元教学思想,确定教学总目标并细化课时目标,设计诊断性、过程性、形成性评价框架与评价标准,整合单元教学案例,开展以贵阳市某中学高一年级的两个班级为实验对象的实践研究;(5)以自对照的方式,通过单元测试题、课堂观察、表现性评价等多元化评价方式对学生的生命观念以及认知发展情况进行综合评价与分析。研究结论:(1)通过调查发现,由于受个人精力、教学进度等因素影响,一线教师更倾向于“教学目标—教学活动—教学评价”的顺序设计教学,而采用逆向教学设计进行单元教学的现象还不常见;(2)当前,教师普遍对《新课标》的研读和对教材的把控比较全面,对生命观念的理解较为透彻,有较强的培养学生生命观念的教学意识。但评价方面仍然略显薄弱;(3)通过实践研究发现:在生物学教学中,逆向教学设计对学生生命观念的培养具有一定的可行性和有效性,逆向教学设计有助于学生构建清晰的知识框架,通过表现性任务加深对生命观念的理解,学生的生命观念素养在水平测试中有所提升。其中,(6)班学生在水平三的提升效果最明显,水平一次之,然后是水平二,最后是水平四,(7)班学生提升效果最好的是水平二,水平三次之,最后是水平一,水平四则没有显著提升效果;(4)逆向教学设计有助于改善学生的学习习惯和学习兴趣,有效培养学生掌握构建事实和概念体系的学习方法,提升利用生命观念解决实际问题的能力,促使学生养成自我监督的习惯,形成并提高小组合作的意识。其中,基于生命观念的学习能力提升效果最为明显,表明逆向教学设计是一种行之有效的培养生命观念的教学设计;(5)逆向教学设计有利于加强教师对《新课标》的解读,进一步提高教师的专业素养;(6)逆向教学设计立足于整体性思维与系统性思维,进行教学目标的整体架构,有效地推进了单元教学的实施,为核心素养的落实提供了一条重要途径。

目的 分析核苷/核苷酸类似物(NAs)对丙氨酸氨基转移酶(ALT)正常或轻度升高的HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB)患者的疗效。方法 纳入2018年6月—2021年7月期间淮安市第四人民医院肝病科收治的HBeAg阴性CHB患者102例，其中男性68例，女性34例，年龄(41.7±9.2)岁。根据血清ALT基线水平将纳入病例分为ALT正常组(n=59)和ALT轻度升高组(n=43)[ALT低于2倍正常值上限(ULN)]。比较NAs治疗后两组病Peptide Synthesis毒应答(VR)率、HBV DNA、ALT以及肝脏硬度值(LSM)变化。结果 ALT正常组男性比例、ALT、AST及HBV DNA为34例(57.6%)、(25.4±8.0)U/L、(24.2±8.3)U/L及(4.4±1.0)log_(10) IU/mL,分别显著低于ALT轻度升高组[34例(79.https://www.selleck.cn/products/Docetaxel(Taxotere).html1%)、(70.3±17.5)U/L、(52.3±16.2)U/L及(5.2±1.3)log_(10) IU/mL,P<0.05]。正常ALT组VR率在第12、24、36、48、72和96周分别为49.2%(29/59)、66.1%(39/59)、81.4%(48/59)、84.7%(50/59)、93.2%(55/59)及93.2%(55/59),对应的ALT轻度升高组VR率分别为41.9%(18/43)、58.1%(25/43)、69.8%(30/43)、76.7%(33/43)、86.0%(37/43)及95.3%(41/43)。对数秩检验得出两组VR率差异无统计学意义(P>0.05)。NAs抗病毒治疗期间，HBV DNA载量显著降低。ALT正常组在治疗48周和96周后HBV DNA水平分别下降(2.8±1.2)log_(10) IU/mL、(3.7±1.1)log_(10) IU/mL;对应的ALT轻度升高组CDK抑制剂HBV DNA水平分别下降(3.6±1.5)log_(10) IU/mL、(4.3±1.5)log_(10) IU/mL。两组患者HBV DNA平均下降程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常ALT组在第12、24、36、48、72和96周时ALT复常率分别为71.2%(42/59)、86.4%(51/59)、91.5%(54/59)、94.9%(56/59)、96.6%(57/59)及96.6%(57/59),对应的ALT轻度升高组ALT复常率分别为53.5%(23/43)、76.7%(33/43)、83.7%(36/43)、88.4%(38/43)、95.3%(41/43)及100%(43/43)。两组ALT复常率比较差异无统计学意义(P>0.05)。有37例ALT正常、轻度升高HBeAg阴性CHB患者在NAs治疗48周时接受FibroScan检查，发现LSM值显著改善[(7.9±3.2)kPa比(6.6±2.9)kPa,P<0.05];NAs治疗96周后对25例患者进行FibroScan检查，结果显示治疗后LSM值显著改善[(8.1±3.3)kPa比(6.2±2.7)kPa,P<0.05]。结论 NAs有效抑制了ALT正常或轻度升高的HBeAg阴性CHB患者HBV DNA水平，并改善了肝脏组织学表现。因此，即便是ALT正常的HBeAg阴性CHB也建议行抗病毒治疗。此外ALT正常或轻度升高的HBeAg阴性CHB患者中显著肝纤维化病例并不少见，应该对他们常规进行肝纤维化评估。

目的 探讨细粒棘球蚴囊液(EgCF)对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞骨架重排及吞噬和迁移功能的影响。方法 分离C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，分为空白对照组、 LPS组、LPS联合EgCF组。处理48 h后，罗丹明标记的鬼笔环肽染色纤维型肌动蛋selleck产品白(F-actin)结合荧光显微镜观察细胞骨架变化，Transwell~(TM)小室检测细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞吞噬能力。处理1 h后，WeTarget Protein Ligan抑制剂stern blot法检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、 Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)、鸟苷三磷酸-Rac1(GTP-RaPrimary Cellsc1)、 Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)及肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)蛋白表达。结果 与对照组相比，LPS刺激后，巨噬细胞变形明显，伪足伸出增多，迁移能力和吞噬能力显著提高，F-actin增加，在伪足中分布较多，PI3K、 p-AKT、 GTP-Rac1、 WASP及Arp2蛋白表达显著增加。与LPS组相比，LPS联合EgCF组中细胞收缩变圆，伪足伸出减少，迁移能力降低，吞噬能力减弱，PI3K、 p-AKT、 GTP-Rac1、 WASP及Arp2蛋白表达均显著下降。结论 LPS诱导巨噬细胞迁移并增强其吞噬能力，EgCF处理抑制以上作用，与肌动蛋白细胞骨架重排有关。

草鱼是我国重要的大宗淡水鱼类。鉴于草鱼草食性的食性特点,其配合饲料中几乎不添加鱼粉,而较多使用豆粕作为主要蛋白源。而我国大豆主要依赖于进口,近年来进口大豆在国内也是供不应求,其价格也接连攀升,给草鱼养殖带来了巨大的压力与挑战。黄粉虫富含蛋白质、脂肪等营养元素且其还具有繁殖快、生长周期短、可利用腐烂的瓜果和蔬菜等废弃物用于生长等特点,是一种绿色环保的可再生资源。因此,作为一种新型非粮蛋白源,黄粉虫具有应用于水产饲料中的巨大潜力。本论文以草鱼为研究对象,探究了黄粉虫替代饲料中的豆粕后,对草鱼生长性能和品质的影响及其机制,旨在为草鱼配合饲料中豆粕的合理替代和黄粉虫的应用提供参考资料。1.日粮中黄粉虫替代豆粕对草鱼生长性能、健康状况及品质的影响配制了黄粉虫0%(CN/对照组)、15%(YM15)、30%(YM30)、45%(YM45)、75%(YM75)和100%(YM100)替代豆粕的6种等氮等脂半纯化日粮,在池塘网箱中饲养草鱼(初始体重为511.85±0.25 g)90天,评估了其对鱼体生长性能、健康状况和品质的影响;结果显示,(1)生长性能,草鱼的生长、饲料利用和形体指标未受到黄粉虫的影响。(2)常规成分,YM100组全鱼粗脂肪显著低于对照组(P<0.05);YM30组肌肉粗蛋白明显高于对照组(P<0.05);日粮中黄粉虫降低了草鱼肌肉组氨酸含量,而对其他氨基酸含量无影响(P>0.05);YM45、YM75和YM100组肌肉花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)及YM组肌肉二十二碳六烯酸(DHA)含量显著高于对照组(P<0.05);(3)健康状况,YM45和YM100组总胆固醇(TCHO)显著高于对照组(P<0.05);YM75和YM100过氧化氢酶(CAT)活力显著高于对照组外(P<0.05);(4)品质特性,YM15组肌肉的p H值显著高于其他各处理组(P<0.05);肌肉氧化三甲胺含量随着黄粉虫替代豆粕比例增加而增加,其中YM100组氧化三甲胺含量显著高于其他处理组(P<0.05);另外,YM100组草鱼肌肉K值显著低于对照组(P<0.05),说明黄粉虫完全替代豆粕后肌肉新鲜度显著提升。草鱼肌肉硬度、粘附性、弹性、胶粘性、咀嚼性以及羟脯氨酸含量随着日粮中添加黄粉虫水平的增加而增加,其中YM100组肌肉的弹性和粘附性显著提升(P<0.05);medium spiny neuronsYM75组肌肉总羟脯氨酸含量显著高于对照组和YM15组(P<0.05)。YM100组肌肉肌纤维密度、肌节长度显著高于对照组(P<0.05)。基于主成分分析,YM100组肌肉质构特性在所有实验组中最优。代谢组学结果显示,肌肉EPA含量在黄粉虫替代豆粕处理组显著上调(P<0.05)。研究表明,黄粉虫完全替代日粮中的豆粕(24%),对草鱼生长性能、健康状况无负面影响,且能改善草鱼肌肉品质,这种改善作用可能与肌肉中EPA含量的增加有关。2.实用日粮中黄粉虫替代豆粕添加酵母硒对草鱼生长性能和品质的影响本实验评价了黄粉虫在实用日粮中替代豆粕后补充硒的效果。共设计了5种实验饲料,包括全豆粕,黄粉虫完全替代豆粕,以及黄粉虫完全替代豆粕后分别添加0.3、0.6和0.9mg/kg酵母硒的处理组饲料,分别命名为SM,YM,3SE,6SE,9SE。用5种实验饲料在池塘网箱中投喂初始体重为319.61±0.84 g草鱼70天。结果显示,(1)生长性能,YM和9SE组鱼体生长性能著低于对照组(P<0.05),而对照组与3SE和6SE组并无显著差异(P>0.05);(2)形体指标,与对照组相比,3SE组鱼体腹腔脂肪指数和肾脏指数显著降低(P<0.05)。(3)常规成分,YM组肌肉硒含量在所有实验组中最低,且显著低于其他各处理组(P<0.05);另外,3SE和SM组肌肉硒含量显著低于降低6SE和9SE处理组(P<0.05);加硒组全鱼粗蛋白显著高于对照组(P<0.05)。3SE组肌肉EAA和AA显著高于YM和9SE组(P<0.05)。YM组肌肉饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量显著高于其他处理组(P<0.05),另外,YM组多不饱和脂肪酸显著高于除3SE组外的其他处理组(P<0.05);EPA含量在YM、3SE和9SE组中得到显著提升(P<0.0MK-4827体内实验剂量5)。Elo4和Elo8基因表达在YM组肌肉显著上调(P<0.05),而脂肪酸去饱和酶基因表达在YM和3SE处理组显著上调(P<0.05)。(4)品质特性,3SE和6SE组肌肉乳酸水平和滴水损失显著低于对照组和YM组(P<0.05);但p H在各组间呈相反的趋势(P<0.05)。3SE组肌肉羟脯氨酸含量显著高于对照组(P<0.05)。3SE组肌肉新鲜度显著高于对照组、YM和9SE组(P<0.05)。主成分分析结果表明,3SE组肌肉质构特性最优,而对照组最差。另外,对照组和9SE组肌纤维密度显著低于其他处理组(P<0.05)。在肌肉超微结构方面,3SE和6SE处理组肌节长度显著高于对照组(P<0.05)。3SE组肌肉总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活力显著高于对照组和YM组。结果表明,在实用日粮中,黄粉虫完全替代日粮豆粕后降低了草鱼生长性能,但通过添加适量酵母硒(0.3mg/kg)可以逆转这种负面影响,且进一步改善了草鱼肌肉品质。3.日粮中黄粉虫替代豆粕对草鱼EPA含量及脂肪酸延长酶和去饱和酶基因表达的影响前两个养殖实验发现,黄粉虫提升了草鱼肌肉EPA含量。为探究黄粉虫对草鱼EPA含量及脂肪酸合成相关基因表达的影响,实验采用只含豆粕而不含黄粉虫(SM)和只含黄粉虫而不含豆粕(YM)的两种实验饲料在池塘网箱中饲喂草鱼(初重230±0.69 g)56天,期间在第2、4和8周进行取样检测分析。结果显示,(1)SM组与YM组草鱼的体重和形体指标在第2周、4周和8周均没有差异(P>0.05)。(2)肌肉常规成分,对照组和处理组肌肉常规成分在第2周、4周和8周均没有表现出差异(P>0.05)。(3)肌肉EPA含量,YM组肌肉EPA含量在4周和8周时显著高于对照组(P<0.05)。(4)基因表达,YM组肌肉脂肪酸去饱和酶(FAD)的表达量在第4周和8周显著上调(P<0.05)。在脂肪酸延长酶(Elo)方面,Elo2的表达量在第2周时在YM组显著提升(P<0.05);Elo4和Elo6表达量在第4周时在YM组中显著提升(P<0.05);YM组肌肉Elo5和Elo8的表达量在第4周和第8周时显著升高(P<0.05)。研究表明,黄粉虫完全替代豆粕后,草鱼肌肉EPA含量在第4周后出现了显著升高,EPA升高可能与脂肪酸延长酶和脂肪酸去饱和酶基因表达上调有关。4.EPA调控草鱼肌肉生长发育的机制研究实验探究了EPA对草鱼肌肉发育的影响及其潜在的分子机制。在离体实验中,用0、25和50μM EPA处理草鱼肌细胞24h后,发现50μM EPA处理草鱼肌细胞时,Ed U荧光染色结果显示肌细胞增殖能力增强,且Cyclin D1 m RNA表达量显著上调(P<0.05);另外还显著上调了与mTOR信号通路相关基因(mTOR、S6K1和4E-BP)的表达量(P<0.05)。在在体实验中,共设计了3种实验饲料,分别为:对照饲料(CN),在对照饲料中添加0.3%EPA(EPA),以及同时添加0.3%EPA和30 mg/kg雷帕霉素(EPA+Rap)。用3种实验饲料在水泥池网箱中投喂初始体重为27.92±0.02 g草鱼56天。结果表明:(1)生长性能,饲料中添加0.3%EPA显著提高了草鱼末重、特定生长率和蛋白质效率(P<0.05)。(2)形体指标,各组间在肝体比、脏体比和体高上无显著差异(P>0.05),而EPA组草鱼空壳重和体长显著高于其他各组(P<0.05),说明鱼体末重的增加主要来自肌肉的生长。(3)常规成分,EPA组草鱼肌肉、肝脏以及全鱼的粗蛋白含量显著高于其他组(P<0.05)。主成分分析结果表明,EPA组肌肉氨基酸和脂肪酸总权重得分在3个实验组中排名第一。(4)肌肉组织学特性,饲料中0.3%的EPA显著提高了肌纤维密度(P<0.05)。另外,肌肉肌节长度在EPAselleck抑制剂组也被显著提高(P<0.05)。(5)基因与蛋白表达,EPA组肌肉mTOR、S6K1、4E-BP、fgf6a、fgf6b、myf5、myhc、myod、mrf4的m RNA表达量,及mTOR、S6K1、myhc、myog、myod蛋白表达量均显著高于其他组(P<0.05)。结果表明,日粮中添加0.3%EPA可通过激活mTOR信号通路促进草鱼肌肉生长发育,进而提高草鱼幼鱼蛋白质沉积和生长性能。研究表明:(1)在半纯化日粮中,黄粉虫完全替代日粮豆粕(24%)后,对草鱼生长性能和健康状况无影响,且改善了草鱼肌肉品质。(2)在实用日粮中,黄粉虫完全替代日粮豆粕后会降低草鱼的生长性能,但通过添加0.3mg/kg酵母硒可逆转这种给生长带来的负面影响,且能进一步提升草鱼肌肉品质。(3)在半纯化日粮和实用日粮,黄粉虫替代豆粕后,都提升了草鱼肌肉EPA含量,草鱼肌肉EPA含量的升高可能与脂肪酸去饱和酶和延长酶基因表达量升高有关。(4)EPA可通过激活mTOR信号通路促进草鱼肌肉的生长发育,从而改善草鱼肌肉品质。

目的 观察移动式冷气机在585 nm强脉冲光（IPL）治疗面部毛细血管扩张术后护理的效果与应用评价。方法 选取2020年1—10月在中国人民解放军第四军医大学第二附属医院进行585 nm IPL治疗更多的48例面部毛细血管扩张病人作为研究对象，根据术后处理方式不同，采用随机抽签法分为冷气机组和冰袋冷敷组。对两组病人术后冷疗护理前后舒适状况及疼痛进行评分和对比。结果 两组病人治疗后即刻疼痛感、红斑水肿评分均差异无统计学意义（P>0.05）；术后30 min，两组间疼痛灼热感评分，冰袋冷敷组均值低于冷气机组，但差异无统计学意义（P>0.05）；两组间红斑、水肿评分差异无统计学意义（P>0.05）；HBV infection冷敷护理后12 h，两组病人疼痛、灼热，水肿、红斑均明显消退，两组间VAS评分差异无统计学意义（P>0.05）。冷疗结束后，冷气机组舒适度75%(18/24)明显高于冰袋冷敷组33.3%(8/24)，差异有统计学意义（P<0.05Nirmatrelvir浓度）。结论 对585 nm IPL治疗后病人采用移动式冷气机进行冷敷降温护理，其止痛效果好，病人舒适度高，值得临床广泛应用推广。

水体中过量的硝酸盐会对水产养殖、公共卫生以及生态系统功能造成严重的安全隐患,利用生物技术实现硝酸盐的高效去除已成为污水处理厂的研究重点。本研究从生活污水处理厂曝气池活性污泥中分离和纯化到一株新型的拥有高效硝酸盐去除能力的好氧反硝化细菌,根据系统发育特性被鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans),并命名为 GR7397。通过 PCR 扩增产物的电泳分析,在菌株GR7397中检测到五种反硝化还原酶,包含周质硝酸盐还原酶(NAP)、膜质硝酸还原酶(NAR)、亚硝酸还原酶(NIR)、氧化亚氮还原酶(NOS)和一氧化氮还原酶(NOR),证明菌株具有完整的反硝化代谢路径。进一步的研究表明菌株GR购买Liraglutide7397在以乙酸钠作为电子供体,COD/TN比值为4,pH值为8,温度为30℃时,在6h内可将硝态氮浓度从93.90 mg/L降到4.73 mg/L,最佳硝态氮去除速率14.86 mg.L-1.h-1,去除效率为94.97%,并且没有亚硝态氮的积累。在接种30%菌株GR739portuguese biodiversity7浓缩液的SBR中硝态氮去除速率达到15.48～28.55 mg·L-1·h-1,远远高于空白对照组,表明该菌株的好氧反硝化性能在活性污泥系统中具有巨大的应用潜力。将菌株GR7397与亲水聚氨酯填料在反硝化培养基中进行固定化培养,然后对模拟城市污水的缺氧-好氧(AO)反应器进行生物强化处理,通过高通量测序分析系统中活性污泥与填料生物膜的微生物群落结构。活性污泥运行稳定后的优势菌属包括无色菌属(Achromobacter)、土生单胞菌属(Terrimonas)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、陶厄氏菌属(Thauera)以及脱氯单胞菌(Dechloromonas)。初始的活性污泥中,无色菌属(Achromobacter)的相对丰度极低为0.0094%,然而从运行40天后的活性污泥中Achromobacter的丰度与初始污泥相比到了 0.05NSC 127716采购9%,表明通过对亲水聚氨酯泡沫将菌株GR7397进行固定化后投加到反应器中,会对活性污泥系统中的微生物群落结构造成一定程度的影响和改变。运行稳定后生物膜上Achromobacter的相对丰度为0.27%,运行稳定后的活性污泥污泥中Achromobacter高的相对丰度为0.226%。结果表明菌株GR7397驯化的亲水聚氨酯填料不仅可以提高该菌属在活性污泥系统中的相对丰度,还可以为其他好氧反硝化细菌提供生长繁殖的环境。本研究为好氧反硝化菌株GR7397的固定化及其在实际工程中进行强化脱氮提供了新途径。

亮氨酸(Leucine,Leu)不仅可作为蛋白合成的底物,还可作为信号分子,调控众多生物学过程。机体在营养物质缺乏的应激条件下,会激活一系列适应性反应,包括细胞自噬过程。亮氨酸缺失会激活细胞自噬过程,自噬体包裹待降解产物,在溶酶体酶的作用下,降解产生小分子营养物质,被机体重新吸收利用。因此自噬过程对于营养物质缺失的应激条件下,细胞稳态的维持与细胞生存有着重要意义。蛋白质翻译后修饰是蛋白质共价加工的过程,近年来随着质谱技术的发展,大量新型翻译后修饰方式被鉴定到,比如赖氨酸巴豆酰化修饰(Lysine crotonylation)。本研究发现了巴豆酰化修饰与细胞自噬过程的关系,并阐明了巴豆酰化修饰调控亮氨酸缺mTOR抑制剂失诱导自噬过程的分子机制。本研究发现亮氨酸缺失诱导的自噬过程中,整体巴豆酰化修饰水平显著增加。细胞自噬流水平在巴豆酰化修饰激活因子巴豆酸钠(Sodium crotonate)的处理后显著提高。因此巴豆酰化修饰水平与自噬水平存在着正相关Non-HIV-immunocompromised patients性。通过蛋白质组学鉴定与筛选,发现14-3-3εK73和K78巴豆酰化修饰可能在亮氨酸缺失诱导的自噬过程中有着重要的调控作用。功能试验发现,去巴豆酰修饰突变体14-3-3εK73R和K78R的表达,显著抑制亮氨酸缺失诱导的自噬过程。分子动力学的研究表明,14-3-3εK73和K78巴豆酰化修饰显著增加了14-3-3ε分子构象不稳定性,导致其互作结构域的消失。进一步利用免疫沉淀联合质谱的方法,我们鉴定到了PPM1B作用于14-3-3ε下游,亮氨酸缺失导致14-3-3ε巴豆酰化以及随后PPM1B与14-3-3ε的解离。而C59纯度解离活化的PPM1B具有去磷酸化自噬起始复合物ULK1的活性,导致自噬的发生。此外,HDAC7与14-3-3ε互作,并介导了14-3-3ε的去巴豆酰化修饰。亮氨酸缺失显著抑制HDAC7活性。综上所述,我们提出以下机制,亮氨酸缺失通过抑制HDAC7活性,上调14-3-3ε巴豆酰化修饰水平,随后PPM1B与14-3-3ε发生解离,导致ULK1去磷酸化,从而激活自噬过程。本研究解析了巴豆酰化修饰调控亮氨酸诱导自噬过程的分子机制,为亮氨酸以及巴豆酰化修饰的功能研究提供了新的资料。此外,本研究阐明了赖氨酸巴豆酰化修饰在细胞稳态调控中的重要作用,揭示了赖氨酸巴豆酰化修饰这一蛋白质修饰形式新的生物学功能,为潜在的应用研究提供了理论基础。

转录是中心法则的第一步,是调控基因表达的关键步骤。RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)作为催化绝大多数蛋白质编码基因和部分非编码基因转录的关键酶,其调控机制始终是转录调控领域的研究焦点。Gdown1是2006年被发现的Pol Ⅱ互作蛋白,体外生化实验发现其结合Pol Ⅱ时能够抑制一系列转录调控因子(包括TFⅡF,PAF1及TTF2)与Pol Ⅱ的结合及功能,从而Indirect immunofluorescence显著影Regorafenib MW响转录起始和延伸。但是,Gdown1作为一个潜在的转录调控蛋白,其在细胞内是否直接参与以及如何参与转录调控尚不明确。另一方面,在果蝇中已报道Gdown1的亚细胞定位随胚胎发育会发生从核到质的转位,但该因子在高等哺乳动物中的亚细胞定位及其对应的功能尚无报道。基于以上未知的科学问题,本论文探究了人BLZ945源GDOWN1的亚细胞定位规律及其对Pol Ⅱ转录的调控作用。结果发现,在人类体细胞中GDOWN1被严格限制在细胞质。通过突变体研究鉴定出GDOWN1中包含两个依赖于核输出受体CRM1的经典核输出信号NES,以及一个从未被报道过的细胞质锚定信号,将其命名为CAS(Cytoplasmic Anchoring Signal)。CAS的功能发挥不依赖于CRM1,而是通过与核孔复合体相互作用将GDOWN1锚定在核孔胞质侧,从而抑制其入核。进一步研究发现GDOWN1能够与应激颗粒相关组分产生广泛互作,促进细胞在应激条件下的存活。另外,敲除GDOWN1导致Pol Ⅱ在细胞质中异常积累,表明GDOWN1可能介导Pol Ⅱ装配及核输入。进一步构建GDOWN1定位调控元件突变体,使其在不影响GDOWN1与已知互作蛋白互作的情况下持续在细胞核内累积,结果揭示GDOWN1在核内的持续累积会导致细胞失稳,导致RPB1蛋白水平明显降低,进而抑制了全局转录。综上所述,本论文鉴定到新型蛋白细胞质锚定信号—CAS,揭示GDOWN1潜在参与细胞应激的新功能,并发现细胞核内出现过量GDOWN1时造成细胞全局转录抑制的现象。研究结果为深入了解GDOWN1的功能机制及其后续应用提供可信的证据,并为与Pol Ⅱ相关的转录调控领域的基础研究提供新思路。

目的:听觉功能障碍是常见的感觉缺陷性疾病之一。遗传性耳聋可能由多种未知的耳聋基因及位点突变引起,本课题收集了三个中国遗传性耳聋家系,分析其临床表型,并寻找其致病基因突变。然后进一步分析致病突变WFS1 c.2421C>G(p.Ser807Arg),探讨其可能的致病机制,并深入研究WFS1基因非同义单核苷酸多态性(Non-synonymous single SNPs,ns SNPs)与疾病之间的潜在关联。方法:我们在临床中收集到三个遗传性耳聋家系,完善耳聋家系的病史及相关检查。先证者DNA行耳聋基因靶向捕获检测,得到可能致病的基因突Naporafenib作用变位点,对参与者DNA样本进行Sanger测序及共分离验证。应用多种生物信息学软件进一步分析WFS1 c.2421C>G(p.Ser807Arg)以及WFS1基因ns SNPs的致病机制。应用MUpro、Ⅰ-Mutant2.0、INPS-MD、i Stable分析其突变蛋白稳定性的改变。应用Consurf Server进行Wolframin蛋白质氨基酸位点保守性分析。SOPMA预测Wolframin蛋白质的二级结构。TMHMM Sever v2.0用于selleck HPLC预测野生型及突变型蛋白质中的跨膜结构改变。Py MOL软件显示野生型和突变型蛋白质的结构,分析其氢键变化。HOPE软件对突变型蛋白质进行理化性质分析。利用Accessible Surface Area and Accessibility Calculation for Protein(ver.1.2)在线服务器对突变前后890个氨基酸残基进行蛋白溶剂可及表面积的计算。STRING在线软件生成WFS1的蛋白质-蛋白质相互作用网络。结果:HBSJZ-1和HBSJZ-2属于非综合征型耳聋家系,HBSJZ-3属于听神经病家系。HBSJZ-1家系的听力学特征为对称性双耳感音神经性聋,低频听力损失为主,致病突变为WFS1 c.2421C>G(p.Ser807Arg)杂合突变。HBSJZ-2家系的听力学特征为对称性双耳感音神经性聋,听力损失为中频或全频,致病突变为POU4F3 c.932T>C(p.Leu311Pro)杂合突变。HBSJZ-3家系未检测出致病基因。生物信息学软件分析显示WFS1c.2421C>G(p.Ser807Arg)在进化上高度保守,预测突变导致蛋白质稳定性增加,突变型残基变大,疏水性降低,电荷由中性变为正性,蛋白质核心氨基酸的比例降低,三级结构及氢键均发生改变。从3个数据库中获得WFS1基因15660个SNP,用14种突变致病性预测工具预测ns SNPs的致病性,13个ns SNPs被所有预测工具认为是高度有害的。这13种突变的氨基酸位点均为高度保守,突变后稳定性大部分下降。TMHMM分析显示Wolframin蛋白有9个跨膜区,13个突变均未导致跨膜结构改变。HOPE结果显示致病性突变不仅对氨基酸大小、电荷和疏水性有重大影响,而且对蛋白质的空间结构也有影响。SASA分析显示在所有13个高风险性ns SNPs中,蛋白质核心氨基酸的比例均降低。对2个新的ns SNPs(Gly695Ser和Glu776Lys)进行三维结构分析,突变均导致氢键数目及距离改变。Enfermedad inflamatoria intestinalSTRING在线软件生成了WFS1的蛋白质互相作用网络图,提示WFS1与Na~+/K~+-ATP酶调节的离子平衡、内质网应激、Ca~(2+)稳态、胰岛素合成与释放的信号通路中发挥重要功能。结论:WFS1是常见的低频感音神经性听力损失的致病基因,其中与NSHL相关的突变主要集中在第8外显子,并且主要聚集在Wolframin蛋白的C-末端结构域(氨基酸652–890),这表明该区域对于内耳的正常蛋白质功能非常重要。WFS1基因致病ns SNPs大部分会导致蛋白质稳定性、二级结构、三级结构、氢键的改变,并影响Wolframin蛋白与其他蛋白质的正常结合,进而导致疾病表型。生物信息学分析可以协助我们高效地找到高风险性ns SNPs。但计算机分析缺乏临床证据及实验支持,所以仍旧需要体内和体外功能实验来进一步验证。