为了解决甘草质量控制成分与功效关联性不强的问题，该研究通过荧光淬灭法检测甘草药材中小分子化学成分与小鼠各脏器总蛋白的相互作用，筛选潜在的活性成分；以HPLC检测甘草中27种化学成分并计算其在34批甘草药材中的缺失率；结合成分有效性和可测性原则共同筛选甘草潜在质量标志物(Q-marker)。再采用微塑料诱导RAW264.7巨噬细胞损伤模型，以CCK-8和GriessZn biofortification法检测细胞活力和一氧化氮含量，采用ELISA法等检测炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP)和氧化应激标志物(SOD、MDA、GSH)水平，验此网站证质量标志物的活性。发现甘草中不同化学成分与各脏器蛋白之间的相互作用强度各不相同，体现出不同的脏器选择性，并筛选出18个活性较强的成分；结合成分HPLC色谱峰信噪比和批间稳定性，最终筛选出芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素以及甘草酸铵等7个化学成分作为甘草药材的潜在质量标志物。体外实验表明，甘草质量标志物可剂量依赖性缓解微塑料诱导的RAW264.7细胞损伤，抑PLX3397体内制细胞炎症因子分泌，减轻细胞氧化应激，且在总剂量相同的条件下，各化学成分合用与单用相比，能够协同增强抗炎、抗氧化作用。该研究确定了与甘草抗炎抗氧化功效相关的质量标志物，可为提高甘草质量控制标准提供参考依据。
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毛叶樟叶绿体全基因组序列特征与系统发育
毛叶樟为樟科樟属常绿阔叶芳香树种，为了解其叶绿体基因组结构及系统发育，本研究利用高通量测序技术，绘制了毛叶樟叶绿体基因组物理图谱，分析了基因组序列特征。毛叶樟叶绿体基因组全长为152 763 bp,GC含量为39.16%，具有一个大单拷贝区(large singdental pathologyle-copy, LSC)、一个小单拷贝区(small CP-456773纯度single-copy,SSC)和两个反向重复区(inverted repeats, IRs)，大小分别为93 684BMS-907351采购、18 931和20 074 bp，共注释得到125个基因，包括36个tRNA基因，8个rRNA基因和81个蛋白编码基因，密码子偏向使用A/T碱基。MISA分析共检测出122个SSRs位点，富含A-T重复。核酸多态性分析结果显示3种樟属植物间的变异度较小，5种樟科植物的变异度较大，其SSC区域为高变区(Pi>0.2)，包括ycf1、ccsA、psaC、rpl32和一系列ndh基因的蛋白编码区。系统分析结果支持毛叶樟为樟组植物，与细毛樟、云南樟聚为一小枝，亲缘关系更近。本研究为毛叶樟保护工作提供重要的遗传背景信息，也为樟属植物的系统进化及分类鉴定研究提供科学依据。
基于福寿螺靶标蛋白PcAdv、PcnWAS和PcRoo的杀螺剂设计研究
福寿螺(Pomacea canaculate)对作物生产、生态环境和人类健康具有较大的威胁,施用化学农药是目前防治福寿螺的常用方法之一,然而实际生产中常见的药剂仅有四聚乙醛、氯硝柳胺等少数几个品种,类别单一化问题突出,已无法实现对福寿螺的有效防控。为了开发新型杀螺剂,本研究采用计算机辅助药物设计的方法,以前期研究发现的福寿螺关键靶标蛋白绒毛蛋白(Advlin,PcAdv)、神经维斯科特-奥尔德里奇综合征同种型X1(neural Wiskott-Aldrich syndrome isoform X1,PcnWAS)和纤毛小根蛋白(Rootletin-like,PcRoo)为基础,利用虚拟筛选的手段获得了一系列具有不同程度杀螺活性的化合物,并以此为基础建立了反映其结构和杀螺活性之间关系的模型,为新型杀螺剂的筛选、定向设计和开发提AZD6738价格供了可借鉴的技术方案。主要结果如下:1.通过计算法对靶标蛋白PcAdv、PcnWAS和PcRoo的三级结构模型及其与探针化合物的结合方式进行了预测,对不同靶标蛋白分别构建了5个模型,并分别选取了能量最低且氨基酸间扭转角排布最合理的三级结构模型。以此为基础,采用蛋白空腔法寻找探针化合物与靶标蛋白的结合区域,结果表明,苦葛皂苷A与靶标蛋白PcAdv、PcnWAS结合能力强的区域分别有5个和3个,槟榔碱与靶标蛋白PcRoo结合能力强的区域有2个。进一步分子对接结果表明,靶标蛋白与探针化合物苦葛皂苷A和槟榔碱结合的位点分别为549号丝氨酸、multiple sclerosis and neuroimmunology585号赖氨酸、112号丙氨酸和47号丝氨酸。2.采用分子对接的手段对Drug Bank数据库中的9213个化合物进行了虚拟筛选。刚性对接结果表明,针对靶标蛋白PcAdv、PcnWAS和PcRoo分别筛选得到排名靠前的化合物各15个。以刚性对接筛选得到的结PD-0332991作用果为基础进行柔性对接,选取到了结合能明显降低的6个化合物,分别为6-四磷酸腺苷甲基-7,8-二氢蝶呤、3,8-二氨基-6-苯基-5-[6-[1-[2-[(1,2,3,4-四氢-9-吖啶基)氨基]乙基]-1-1,2,3-三唑]己基]-菲啶、海藻酸钾、硫代辅酶腺嘌呤二核苷酸、巴氯芬和醋苯氨酸。3.研究了海藻酸钾、硫代辅酶腺嘌呤二核苷酸、巴氯芬和醋苯氨酸对福寿螺的毒杀活性。室内生物活性测定结果表明,硫代辅酶腺嘌呤二核苷酸和巴氯芬毒杀福寿螺的LC_(50)值分别为16.2437 mg/L和57.7102 mg/L。生理特征变化及生化指标测定结果表明,化合物海藻酸钾、硫代辅酶腺嘌呤二核苷酸和巴氯芬可以导致福寿螺产生中毒症状,具体表现为排泄物异常增多、耗氧率排氨率及氧氮比降低、血蓝蛋白含量降低、鳃部纤毛脱落及靶标蛋白基因表达量降低,这些症状与探针化合物苦葛皂苷A和槟榔碱处理后福寿螺的中毒症状相同。进一步采用等温滴定量热法研究了候选化合物与靶标蛋白的结合情况,结果显示,靶标蛋白PcnWAS与化合物海藻酸钾、硫代辅酶腺嘌呤二核苷酸能够发生体外结合,结合常数分别为2.17±0.51×10~(-4)/M和2.08±0.94×10~(-4)/M。4.以苦葛皂苷A为模板,建立了反映杀螺化合物结构与活性的药效团模型和3D-QSAR模型。药效团模型构建结果表明,该模型包含4个化学特征元素,具体包括2个疏水作用基团和2个氢键受体基团,且化合物的药效团特征元素与杀螺活性具有一定的几何约束关系,疏水作用基团与两个氢键供体基团和两个氢键受体的间的距离比例为13.624:10.516:5.895。3D-QSAR结果表明苦葛皂苷A及其它五环三萜及皂苷类化合物的结构和杀螺活性存在较高的相关性。通过对立体场、静电场、疏水场、氢键供体场和氢键受体场进行改变,设计出了3个新颖的具有杀螺潜力的皂苷类化合物,分子对接结果显示这些化合物与靶标蛋白结合后结合能明显降低。以上结果表明从PcAdv、PcnWAS和PcRoo的结构入手,利用基于靶标蛋白的药物设计方法可以获得新的杀螺化合物,该研究为新型杀螺化合物的研发奠定了基础。
平菇黄斑病品种抗性分化及抗病基因研究
平菇(Pleurotus ostreatus)是世界范围内广泛栽培的食用菌之一。平菇细菌性黄斑病是生产过程中常见的一种病害,严重影响产量和品质,常造成重大的经济损失。托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)是引起平菇黄斑病的主要病原菌,平菇品种对托拉斯假单胞杆菌的抗性差异较大,本课题在评价平菇品种黄斑病抗性的基础上,选择两个抗性差异品种,研究平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制,及品种间抗性差异的原因,主要结果如下:1.将托拉斯假单胞杆菌接种32个平菇品种,于接种后24 h统计病情指数,发现华平36、平8129、特抗650、平早秋615抗病性最好,而黑美89、夏灰1号、华平801品种抗性最差。2.选择抗性差异最大的两个品种(华平801和华平36),将其子实体接种托拉斯假单胞杆菌后,于接种12 h、24 h和72 h后观察症状。发现敏感品种华平801接种12 h后菌盖便出现轻微黄化,24 h表现为大面积黄褐色斑,72 h子实体严重萎缩,呈现水渍状,菌盖全部黄化;而华平36品种在接种病原细菌12 h和24 h后均无症状,接种72 h后菌盖出现少数不扩展的黄色斑点。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜,观察将各时间点患病和健康子实体样本的超微结构。发现两品种菌丝形态和细胞形态差异很大,感病品种接种表面分布大量细菌,菌丝基本全部被细菌包埋,出现断裂和孔洞,而抗病品种细菌分布非常少;感病品种细胞严重变形,产生大量囊泡,细胞内容物外泄,线粒体也发生变形,而抗病品种没有这些细胞变化或轻度发生。3.对各时间点患病及健康样本进行了酶活性测定,结果发现接种托拉斯假单胞杆菌后平菇子实体酪氨酸酶活性、超氧化物歧化酶活性、细胞内丙二醛含量产生变化。抗病品种的酪氨酸酶活性和细胞内丙二醛含量显著低于敏感品种,超氧化物歧化酶活性显著高于敏感品种,表明感病品种酪氨酸酶被激活,细胞受损伤程度大,清除活性氧能力弱。4.对两个品种各时间点患病及健康样本进行了转录组测序,Gene OntCX-5461配制ology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析结果说明,对于敏感品种华平801,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在氧化磷酸化、线粒体跨膜转运、活性氧、奥斯丁醇代谢等生物过程;接种24 h后的差异表达基因主要富集在甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、羧酸代谢、氧化还原酶活性等过程;72 h的差异表达基因主要富集在单氧酶活性、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢过程;而抗性品种华平36,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在芳基醇脱氢酶活性、青霉素和头孢菌素生物合成等生物过程;接种24 h后的差异表达基因未富集到显著的生物过程;72 h的差异表达基因主要富集在甲苯降解、甲酸代谢等途径。时间序列分析结果表明,华平801品种不同表达模式的基因聚类到8个模块,华平36品种不同表达模式的基因聚类到6个模块。5.结合共表达网络分析结果,基于基因功能注释,构建了平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的模型:平菇细胞感受到病原细菌侵染的信号后,通过信号转导途径转导至胞内,编码谷胱甘肽S-转移酶、苯丙氨酸和组氨酸解氨酶、MFS转运蛋白等解毒酶基因被激活,同时细胞色素p450也参与将有毒物质转化或排至细胞外;过氧化物酶基因被激活Cobimetinib以抵抗活性氧的损伤,同时细胞核内进行DNA修复以抵御病原菌的伤害,细胞色素c参与细胞凋亡以维持内环境稳定;膜结构被破坏导致酚类物质被释放,脂肪酸含量升高使细胞膜流动性增大,酪氨酸酶基因被激活,催化酚类物质产生黑色素,造成黄斑症状。6.基于比较转录组信息,分析了平菇品种抗性差异的原因。对照敏感品种,抗病品种中编码真菌毒性、溶菌酶等基因大量上调表达,使细菌不能定殖、增殖;抗病品种细胞受损伤程度小,而感病品种细胞膜受破坏程度大,细胞内容物外泄严重,线粒体受损伤大,细胞不能正常生长;抗病品种酪氨酸酶基因未显著上调表达,酪氨酸酶活性低,无法氧化酚类物质造成黄斑症状;抗病品种SOD酶在接种细菌后一直处于较高水平,可以有效清除活性氧损伤,而感病品种后期SOD酶活性很低。7.于转录组测序结果中挑选出30个候选基因,这些基因在抗性和感病品种间显著差异性表达,并且在其他物种中与抗病性相关,其中包括编码乙醇脱氢酶、溶菌酶、丝氨酸/苏氨酸激酶的基因。测定了这些候选基因在各平菇品种患病子实体中的表达量,与各个品种的病情指数做相关性分析发现,乙醇脱氢酶基因(gene＿6990)、鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)的相对表达量与病情指数间呈显著正相关性;细菌α-l-鼠李糖苷酶发夹结构域基因(gene＿4782)、溶菌酶基因(gene＿6008)、乙醇脱氢酶基因(gene＿5811)相对表达量与病情指数呈显著负相关性。在华平36和华平801品种中克隆了具有相关性的候选基因,发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)和鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)在两品种间有大量单核苷酸多态性和插入/缺失位点,后续可用于筛选快速鉴定平菇品种抗性的分子标记。本课题对平菇群体进行了抗病性鉴定,筛选出了黄斑病抗性平菇品种,挖掘了部分抗病相关基因,对平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制及平菇品种抗性差异的原因进行了研究,有助于深入研究食用菌细菌性黄斑病的发生机制,为平菇的抗性育种和食用菌细菌性黄斑surrogate medical decision maker病的高效防治提供了参考依据。
血小板膜仿生纳米载体的制备和表征及其体外跨胎盘屏障转运效率研究
利用血小板膜(PM)包覆聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒(PLGA NPs),制备成血小板膜仿生纳米粒(P-PLGA NPs)作为药物载体，评价载体的体外跨胎盘屏障转运效率。分别通过超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备P-PLGA NPs。利用粒径仪、透射电镜、能谱仪、SDS-PAGE和Elisa对P-PLGA NPs的理化特性表征，确定最优的制备方法。MTT法考察纳米载体对人绒毛膜癌细胞(BeWo b30)的毒性；流式细胞术探究BeWo b30摄取纳米载体的途径；利用Transwell构建体外胎盘屏障模型，考察纳米载体体外跨胎盘屏障效率。结果显示，PLGA NPs粒径为(174.1±23.4)nm,电势为(-32.3±5.6)mV,PM电势为(-24.5±1.8)mV;超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备的P-PLGA NPs粒径分别为(269.1±32.9)、(425.0±36.6)、(823.4±73.1)nm,电势分别为(-24.1±3.8)、(-26.4±2.3)、(-23.5±2.9)mV,均显著高于PLGA NPs(P<0.05),接近PM电势；表面膜蛋白条带完整且均有特异性蛋白标志物P-选择素存在，初步证明血小板膜成功包覆在PLGA NPs表面。纳米载体在10～1 00molecular and immunological techniques0Emricasan半抑制浓度μg/mL浓度范围内，细胞存活率为90.5%～105.0%,和对照组相比差异无统计学意义，表明载体对细胞无明显毒性；与对照组相比，PLGA NPs组制霉素(NY)摄取抑制率为53%,P-PLGA NPs组阿米洛利(AMR)摄取抑制率为45%,初步证实摄取途径分别为小窝蛋白介导的内吞途径和巨胞饮途径。在胎盘屏障模型中，上室给药浓度为5和20μg/mL时，PLGA NPs转运效率分别高出P-PLGA NPs 1.6%和24.3%;上室给药浓度为100μg/mL时，P-PLGA NPs转运效率高出PLGA NPs 13.8%。研究表明，超声复合法制备的GSK1120212P-PLGA NPs粒径较小，分散均匀；增加纳米载体浓度，P-PLGA NPs跨胎盘屏障转运效率增高。
芳香族有机气溶胶形成机制与细胞毒性研究
芳香化合物是二次有机气溶胶(Secondary Organic AerosoPCI-32765说明书ls,SOA)中一类重要的前体物,由生物质燃烧、化石燃料蒸发、燃烧释放等方式排放到大气中,通过光氧化作用形成气溶胶,对大气环境及人体健康造成有害影响。Chemical and biological properties甲苯及多氯联苯是芳香化合物的主要成分,然而其气溶胶形成机制与细胞毒性机制尚不完全清楚。对此,本研究将分子动力学(Molecular Dynamics,MD)方法和密度泛函理论(Density Functional Theory,DFT)相结合,通过分析其动力学和热力学性质来阐明甲苯SOA成核的分子化学机制。此外,本文以毒性较高的多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls,PCBs)为例系统研究SOA的细胞毒性机制。对此,本研究提出了一个分层多尺度框架,通过整合实验技术、密度泛函理论和由自适应增强的一维和二维自由能采样驱动的微秒级分子动力学模拟研究PCBs的细胞易位特性,进而阐明细胞毒性。研究结果表明,分子等级协同效应使得SOA形成特殊的核壳纳米粒子结构;H_2SO_4–H_2O团簇为核结构,光氧化过程中产生的丙酮酸充当“桥梁”,促进苯甲醛和苯甲酸在H_2SO_4–H_2O团簇表面稳定聚集。此外,化学组分和环境温度对甲苯SOA氢键的概率分布和寿命具有关键影响,缺少丙酮酸的模拟系统的氢键数量和氢键存在概率比其他模拟系统低,同时也改变了甲苯SOA从气体到纳米颗粒转化的能垒。分子间相互作用表明,静电相互作用selleck NVP-TNKS656较范德华相互作用是导致形成稳定甲苯SOA纳米颗粒的主要驱动力。研究结果揭示了大气气溶胶的分子化学性质,揭示分子分级协同效应是大气气溶胶形成过程的关键因素。此外,源自差异性非共价结合的权衡效应在动力学和热力学决定PCBs的易位路径。具体地,补偿良好的非共价键合(结合亲和力差异<14.5 kcal/mol)导致PCBs经历“翻转(Ⅰ→Ⅲ)插入-摄取”的五步跨生物膜运输途径,而严重差异化的非共价键合加剧了PCBs在生物膜表面上的竞争性活性结合,导致PCBs纳米粒子仅仅聚集在细胞膜表面。此外,本研究还利用Zeta电位及细胞毒性实验分别表征了PCBs纳米粒子的溶液分散性及细胞毒性,细胞毒性与PCBs跨膜输运能垒正相关,实验结果与模拟结果在动力学及热力学方面吻合。本文基于实验技术、密度泛函理论和分子动力学模拟方法系统研究了芳香族化合物二次有机气溶胶形成机制,继而研究了其相关细胞毒性机制,对大气污染与防治提供理论指导。
铜纳米团簇基抗菌剂的设计及其广谱抗菌应用研究
细菌是人类众多疾病的病原体,而抗菌技术开发对于人类健康和环境具有重要意义。如今,抗生素是人类解决细菌感染问题的有效手段。然而,抗生素虽然可以解决大部分细菌感染的问题,但随之而来的是可能更加严重的细菌耐药性危机。因此,开发新型、无耐药性抗菌剂已经迫在眉睫。金属纳米团簇(Metal nanoclusters,MNCs)是尺寸小于3 nm的超小金属纳米颗粒。MNCs相比传统纳米材料具有尺寸优势,可更容易地穿过细菌的外部屏障(细胞壁和细胞膜)进historical biodiversity data入细菌内部,从而实现高效抗菌。加之,MNCs表面丰富的活性位点有利于催化细菌内部的生化反应,进一步提高了其抗菌活性。目前,金/银纳米团簇(Au/Ag NCs)的精确合成及结构调控已经趋于成熟,并成功应用于广谱抗菌。但Au、Ag元素的丰度都较低,使其商业化应用受到限制。Cu元素(与Au、Ag同为IB族)在地壳中储量较高,相对Au、Ag具有更广阔的产业化前景。然而,由于铜离子难以还原,铜纳米团簇(Cu NCs)的合成及其广谱抗菌研究一直处于滞后状态。综上,本论文旨在解决耐药菌感染的问题,设计了半胱氨酸保护Cu NCs(Cys-Cu(Ⅰ)NCs)、AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA)和AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs)等铜基纳米材料,研究了其在广谱抗菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的伤口治疗的性能。具体工作如下:(1)首先,本文采用pH调节的配体还原法制备了低成本的Cys-Cu(Ⅰ)NCs,并成功应用于耐药菌感染的治疗。抗菌测试显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs具有优异的广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌MRSA均具有高效的杀菌率。另外,由于Cys的配位作用,Cys-Cu(Ⅰ)NCs相对于Cu SO_4表现出了超低的细胞毒性,反映了其良好的生物相容性。在此基础上,本章进一步对其杀菌机制进行了研究,结果发现Cys-Cu(Ⅰ)NCs能够通过类酶催化产生活性氧物种(ROS)和释放铜离子的双重机制,破坏细菌的细胞壁和细胞膜,扰乱细菌内部的代谢活动,最终杀灭细菌。在上述工作的基础上,本文进一步制备了Cys-Cu(Ⅰ)NCs均匀分散的卡波姆透明凝胶(Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel),并探索了其作为伤口敷料对MRSA(代表性耐药菌)感染的小鼠伤口愈合的作用。结果显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel可以有效根除MRSA,表现出促进耐药菌感染伤口愈合的优异特性,为纳米材料治疗耐药菌感染的研究提供了范例。(2)上述研究发现,Cu NCs虽然具有优异的广谱抗菌活性,但由于其释放接触型杀菌机制,该系列抗菌剂缺乏抗菌的长效性,这也是大部分铜基纳米抗菌剂面临的难题。聚集诱导发光(AIE)机制的Au NCs(AIE-Au NCs)通过光催化的方式持续产生杀灭细菌的ROS,解决了MNCs抗菌持久性不足的问题。然而,Au基体系的高昂成本限制了其商业化应用。因此,本课题理性设计了AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA),解决了铜基纳米材料面临的抗菌短效性的问题。具体讲,本研究使用对巯基苯甲酸(p-MBINCB28060分子式A)合成了原子精确的链状Cu(Ⅰ)络合物。结果发现,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物在碱性的水相环境处于分散的状态,其不能发射荧光。然而,通过降低溶液pH和引入乙醇溶剂,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物出现聚集。并且随着溶剂中乙醇体积分数的提高,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的聚集度升高,进而出现了AIE现象。然而,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的AIE特性依赖于乙醇溶剂的引入,这限制了其在光动力广谱抗菌的应用。为了摆脱对溶剂的依赖,本研究创新性地利用聚乙二醇(PEG)等高分子的空间限域作用,成功制备了水相环境中稳定且AIE机制发光的PCuA。制备的PCuA不仅表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,也展现了良好的生物相容性。抗菌机理研究显示,AIE机制的PCuA具有良好的可见光吸收,微秒级的光生载流子寿命和合理的能级结构,使得其能够在可见光驱动下产生ROS,提高了抗JQ1浓度菌的活性和长效性。该工作为AIE机制发光聚集体的制备以及光动力广谱抗菌研究提供了范例。(3)上述研究表明,AIE机制发光的PCuA具有光动力增强的广谱抗菌活性,缓解了铜基纳米抗菌剂长效性不足的问题。然而,高分子限域策略虽然实现了Cu(Ⅰ)络合物聚集体(AIE机制发光)在水相环境中的稳定存在,但PCuA尺寸过大且难以修饰,这限制了其抗菌性能的进一步的提升。前文已述,MNCs基抗菌剂具有超小尺寸和丰富且可调的表面化学的本征优势。因此,将AIE发光机制引入Cu NCs,不仅能够避免高分子限域策略的缺陷,也可以降低MNCs的抗菌成本和提高MNCs的抗菌长效性。基于此,本章首先制备了原子精确的Cu(Ⅰ)-GSH络合物。通过降低pH和引入不良溶剂(DMF和乙醇)诱导Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集后,本研究发现了Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE活性。本章以Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE研究为基础,在高温(80°C)条件下成功制备了AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs),并实现了简单的pH驱动的Cu(0)核表面Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集度的调控,进而调制了AIE-Cu NCs的荧光颜色。得益于AIE发光机制,AIE-Cu NCs能够在可见光驱动下产生更多的ROS,表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,另外,AIE-Cu NCs也具有良好的生物相容性。在此基础上,本研究进一步制备了含有AIE-Cu NCs的卡波姆透明凝胶(AIE-Cu NCs-gel)。动物实验表明,AIE-Cu NCs-gel表现出了光动力促进MRSA感染的伤口愈合的优异性能。该工作为抗菌剂的设计和MNCs的合成提供了研究范例。
铜纳米团簇基抗菌剂的设计及其广谱抗菌应用研究
细菌是人类众多疾病的病原体,而抗菌技术开发对于人类健康和环境具有重要意义。如今,抗生素是人类解决细菌感染问题的有效手段。然而,抗生素虽然可以解决大部分细菌感染的问题,但随之而来的是可能更加严重的细菌耐药性危机。因此,开发新型、无耐药性抗菌剂已经迫在眉睫。金属纳米团簇(Metal nanoclusters,MNCs)是尺寸小于3 nm的超小金属纳米颗粒。MNCs相比传统纳米材料具有尺寸优势,可更容易地穿过细菌的外部屏障(细胞壁和细胞膜)进historical biodiversity data入细菌内部,从而实现高效抗菌。加之,MNCs表面丰富的活性位点有利于催化细菌内部的生化反应,进一步提高了其抗菌活性。目前,金/银纳米团簇(Au/Ag NCs)的精确合成及结构调控已经趋于成熟,并成功应用于广谱抗菌。但Au、Ag元素的丰度都较低,使其商业化应用受到限制。Cu元素(与Au、Ag同为IB族)在地壳中储量较高,相对Au、Ag具有更广阔的产业化前景。然而,由于铜离子难以还原,铜纳米团簇(Cu NCs)的合成及其广谱抗菌研究一直处于滞后状态。综上,本论文旨在解决耐药菌感染的问题,设计了半胱氨酸保护Cu NCs(Cys-Cu(Ⅰ)NCs)、AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA)和AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs)等铜基纳米材料,研究了其在广谱抗菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的伤口治疗的性能。具体工作如下:(1)首先,本文采用pH调节的配体还原法制备了低成本的Cys-Cu(Ⅰ)NCs,并成功应用于耐药菌感染的治疗。抗菌测试显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs具有优异的广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及耐药菌MRSA均具有高效的杀菌率。另外,由于Cys的配位作用,Cys-Cu(Ⅰ)NCs相对于Cu SO_4表现出了超低的细胞毒性,反映了其良好的生物相容性。在此基础上,本章进一步对其杀菌机制进行了研究,结果发现Cys-Cu(Ⅰ)NCs能够通过类酶催化产生活性氧物种(ROS)和释放铜离子的双重机制,破坏细菌的细胞壁和细胞膜,扰乱细菌内部的代谢活动,最终杀灭细菌。在上述工作的基础上,本文进一步制备了Cys-Cu(Ⅰ)NCs均匀分散的卡波姆透明凝胶(Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel),并探索了其作为伤口敷料对MRSA(代表性耐药菌)感染的小鼠伤口愈合的作用。结果显示,Cys-Cu(Ⅰ)NCs-gel可以有效根除MRSA,表现出促进耐药菌感染伤口愈合的优异特性,为纳米材料治疗耐药菌感染的研究提供了范例。(2)上述研究发现,Cu NCs虽然具有优异的广谱抗菌活性,但由于其释放接触型杀菌机制,该系列抗菌剂缺乏抗菌的长效性,这也是大部分铜基纳米抗菌剂面临的难题。聚集诱导发光(AIE)机制的Au NCs(AIE-Au NCs)通过光催化的方式持续产生杀灭细菌的ROS,解决了MNCs抗菌持久性不足的问题。然而,Au基体系的高昂成本限制了其商业化应用。因此,本课题理性设计了AIE机制发光的Cu(Ⅰ)络合物聚集体(PCuA),解决了铜基纳米材料面临的抗菌短效性的问题。具体讲,本研究使用对巯基苯甲酸(p-MBINCB28060分子式A)合成了原子精确的链状Cu(Ⅰ)络合物。结果发现,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物在碱性的水相环境处于分散的状态,其不能发射荧光。然而,通过降低溶液pH和引入乙醇溶剂,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物出现聚集。并且随着溶剂中乙醇体积分数的提高,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的聚集度升高,进而出现了AIE现象。然而,Cu(Ⅰ)-p-MBA络合物的AIE特性依赖于乙醇溶剂的引入,这限制了其在光动力广谱抗菌的应用。为了摆脱对溶剂的依赖,本研究创新性地利用聚乙二醇(PEG)等高分子的空间限域作用,成功制备了水相环境中稳定且AIE机制发光的PCuA。制备的PCuA不仅表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,也展现了良好的生物相容性。抗菌机理研究显示,AIE机制的PCuA具有良好的可见光吸收,微秒级的光生载流子寿命和合理的能级结构,使得其能够在可见光驱动下产生ROS,提高了抗JQ1浓度菌的活性和长效性。该工作为AIE机制发光聚集体的制备以及光动力广谱抗菌研究提供了范例。(3)上述研究表明,AIE机制发光的PCuA具有光动力增强的广谱抗菌活性,缓解了铜基纳米抗菌剂长效性不足的问题。然而,高分子限域策略虽然实现了Cu(Ⅰ)络合物聚集体(AIE机制发光)在水相环境中的稳定存在,但PCuA尺寸过大且难以修饰,这限制了其抗菌性能的进一步的提升。前文已述,MNCs基抗菌剂具有超小尺寸和丰富且可调的表面化学的本征优势。因此,将AIE发光机制引入Cu NCs,不仅能够避免高分子限域策略的缺陷,也可以降低MNCs的抗菌成本和提高MNCs的抗菌长效性。基于此,本章首先制备了原子精确的Cu(Ⅰ)-GSH络合物。通过降低pH和引入不良溶剂(DMF和乙醇)诱导Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集后,本研究发现了Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE活性。本章以Cu(Ⅰ)-GSH络合物的AIE研究为基础,在高温(80°C)条件下成功制备了AIE机制发光的Cu NCs(AIE-Cu NCs),并实现了简单的pH驱动的Cu(0)核表面Cu(Ⅰ)-GSH络合物聚集度的调控,进而调制了AIE-Cu NCs的荧光颜色。得益于AIE发光机制,AIE-Cu NCs能够在可见光驱动下产生更多的ROS,表现出了光动力增强的广谱抗菌活性,另外,AIE-Cu NCs也具有良好的生物相容性。在此基础上,本研究进一步制备了含有AIE-Cu NCs的卡波姆透明凝胶(AIE-Cu NCs-gel)。动物实验表明,AIE-Cu NCs-gel表现出了光动力促进MRSA感染的伤口愈合的优异性能。该工作为抗菌剂的设计和MNCs的合成提供了研究范例。
自闭症大鼠模型建立与吴茱萸碱衍生物治疗阿尔茨海默病研究
背景:自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一种复杂的、具有高度遗传异质性的神经发育障碍疾病。遗传因素与环境因素的刺激等多种因素均是引起ASD发病的危险因素。四次跨膜蛋白7(Tetraspanin7,TSPAN7)是一种由位于X染色体上的Tspan7基因所编码的细胞表面糖蛋白,在脑组织中高度表达。在生理状态下,TSPAN7参与突触传递、神经元形态发生、树突状细胞(dendritic cell,DCs)和破骨细胞形态发生。研究发现,Tspan7的拷贝数变异与人类ASD的发生和发展密切相关。然而,TSPAN7在ASD的突触和突触完整性层面的潜在机制仍不清楚。为探究TSPAN7在自闭症中的作用,我们利用CRISPR/Cas9技术构建一个Tspan7基因敲除大鼠品系,以期建立Tspan7基因敲除的ASD大鼠模型,并利用该模型探究TSPAN7在自闭症中的作用机制。方法:(1)利用生物信息学分析、PCR、蛋白质印迹(Western blot,WB)和免疫荧光检测TSPAN7序列特征和表达谱。(2)通过CRISPR/Cas9技术构建Tspan7基因敲除大鼠品系(Tspan7-/-),并利用PCR和WB对其进行基因型鉴定和蛋白表达鉴定。(3)通过旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验对野生型(Wild Type,WT)大鼠和Tspan7-/-大鼠在刻板行为、快感缺失、社交活动、学习记忆等四方面自闭症的行为表型进行分析。(4)应用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)、苏木素伊红染色(haematoxylin-eosin staining,HEPARP抑制剂)和 Nissl 染色分析Tspan7-/-大鼠整体脑结构和神经元数量的改变。(5)通过qRT-PCR和Golgi-Cox染色观察Tspan7-/-大鼠大脑ASD相关基因的表达和神经元分支和树突棘数量的改变。采用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测Tspan7-/-大鼠大脑神经元突触完整性。(6)采用WB和IF分析TSPAN7缺失引起的下游信号通路的表达变化。结果:(1)在生理条件下,TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,在大鼠脑组织中表达最高。同时,TSPAN7蛋白在出生时表达较低,从0.5月龄开始至4月龄TSPAN7的表达明显增加。TSPAN7的亚细胞定位主要是在神经元细胞膜上高度表达。在病理条件下,TSPAN7在ASD、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者的脑组织中呈现低表达趋势,表明TSPAN7在神经系统疾病的发展进程中起关键作用。(2)成功构建Tspan7基因敲除大鼠,旷场、糖水偏好、三箱社交、Y迷宫和Morris水迷宫实验结果显示Tspan7-/-大鼠表现出刻板行为增多、快感降低、社交减少以及学习记忆损伤等ASD的典型行为学表型。(3)影像学结果显示:Tspan7-/-大鼠在整体水平表现出海马和大脑皮层体积减小的大脑结构的改变。(4)组织形态学显示,Tspan7-/-大鼠大脑海马区神经元数目减少并且排列松散。Tspan7-/-大鼠海马和大脑皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少。(5)TSPAN7缺失导致大鼠大脑海马和皮层PSD95和SYN等突触相关蛋白表达和PSD95免疫标记的突触后膜和SYN免疫标记的突触前膜重叠点明显减少。(6)TSPAN7缺失抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路的激活,进而下调PSD95、SYN和GluR1/2等突触相关蛋白的表达。(7)在Tspan7-/-大鼠原代神经元中,原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC(Proto-Oncogene Tyrosine-Protein Kinase Src,SRC)的重新激活能够恢复 PSD95、SYN 和GluR1/2等突触相关蛋白的表达和突触完整性。结论:TSPAN7在哺乳动物中的蛋白序列是高度保守的,并且在神经系统疾病的发展中起关键作用。我们成功构建Tspan7-/-大鼠,该大鼠出现刻板行为增多、快感降低及社交减少等行为学改变,再现人类ASBcl-2抑制剂D行为学表型;Tspan7-/-大鼠海马和皮层的神经元树突和轴突分支、神经元复杂度、神经元顶端树突和基底树突的树突棘明显减少,与人类ASD的脑组织病理学改变具有相似性;Tspan7-/-大鼠可作为人类ASD的动物模型。利用模型发现TSPAN7缺失通过抑制Integrinβ1/FAK/SRC信号通路激活,引起突触相关蛋白降低和突触完整性损失,是导致ASD的重要发病机制。背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。遗传因素和环境因素等多方面危险因素,造成治疗和药物研发的困难,目前有限的几种药物存在多种不良反应。因此,AD药物研发是迫切需要的。随着对中药成分的深入了解,研究发现吴茱萸碱(evodiamine,Evo)可以改善AD模型小鼠的学习认知功能障碍。然而,Evo具有较高的细胞毒性和较差的生物活性,将Evo直接用于临床AD的治疗是不可行的。因此,本课human cancer biopsies题通过杂环取代和酰胺引入,设计和合成一系列的Evo衍生物,并从中筛选出具有较低细胞毒性和较高生物活性的化合物4c,并探究其治疗AD的作用机制。方法:(1)使用1,2-二甲氧基苯替代吴茱萸碱的吲哚环,通过杂环取代,合成吴茱萸碱衍生物,并通过核磁共振、高分辨质谱对其结构进行鉴定分析。(2)使用吴茱萸碱衍生物干预SH-SY5Y和HepaG2细胞系,利用CCK-8、Calcein-AM/PI染色和xCELLigence实时细胞分析等方法检测其细胞毒性、抗H2O2和AβOs活性。(3)将筛选出的化合物4c进行体内实验,将化合物4c腹腔注射至3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠体内,并利用Y迷宫和Morris水迷宫检测化合物4c对两种AD模型小鼠学习记忆损伤的治疗作用。(4)通过免疫荧光、免疫组化、免疫印迹等方法评价化合物4c对3×Tg和APP/PS1两种AD模型小鼠脑内Tau过度磷酸化、淀粉样物质的聚集和神经胶质细胞增生水平的影响。(5)利用转录组测序分析化合物4c对3×Tg模型小鼠后海马组织的mRNA表达的影响,并对其差异基因进行KEGG和PPI网络分析。(6)通过qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光对差异基因进行验证,并分析化合物4c治疗AD潜在的作用机制。结果:(1)以吴茱萸碱为原型,通过杂环取代,共合成21种吴茱萸碱衍生物。其中,化合物4c具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2活性。(2)与吴茱萸碱相比,化合物4c表现出更高的LD50、抗H2O2和AβOs能力。(3)在Y迷宫实验中,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg和APP/PS1模型小鼠的自发交替正确率明显增加;Morris水迷宫实验结果显示,与模型对照组相比,化合物4c干预组3×Tg模型小鼠潜伏期探索隐藏平台的时间明显缩短,小鼠平台穿越次数、目标象限持续时间明显增加。提示,化合物4c明显改善AD模型小鼠的工作记忆和空间学习记忆。(4)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内Ser202/Thr205(AT8),Thr231(T231)和Thr181(T181)等磷酸化位点的Tau磷酸化水平下降。(5)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮层的Aβ单体、寡聚体和淀粉样物质的聚集明显较少。(6)化合物4c干预组APP/PS1小鼠海马和皮质中Aβ斑块周围的小胶质细胞和星形细胞的聚集明显减少。(7)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内胰岛素信号、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)等AD相关信号通路相关mRN A表达明显下降。(8)化合物4c干预组3×Tg模型小鼠脑组织内PI3K和AKT的磷酸化水平显著增加,下游GSK3β蛋白的磷酸化水平显著下降,研究结果提示,化合物4c可改善AD模型小鼠脑组织内PI3K/AKT/GSK3β信号通路的损伤。(9)细胞实验结果显示,化合物4c改善Aβ引起的SH-SY5Y细胞内PI3K/AKT/GSK3β/Tau 功能紊乱。结论:本课题通过杂环取代和酰胺引入,设计并合成一系列吴茱萸碱衍生物,从中筛选出化合物4c,经研究发现化合物4c在体外具有较低的细胞毒性和较高的抗H2O2和AβOs活性,在体内研究证实化合物4c明显改善AD模型小鼠行为学损伤、减少AD模型小鼠脑组织内β淀粉样物质的聚集、Tau的过度磷酸化以及胶质细胞的增生。同时,与吴茱萸碱相比,化合物4c的LD50提高2倍,体内治疗的有效剂量降低约500倍,化合物4c是一种改进成功的治疗AD的先导化合物。此外,为探究化合物4c的作用机制,通过RNA-seq和通路富集分析发现,化合物4c能够影响AD相关基因、AMPK和胰岛素信号通路相关基因的表达。通过体内和体外实验证实化合物4c可以改善PI3K/AKT/GSK3β/Tau的功能障碍。
功能化阳离子聚合物介导磷酸腺苷化蛋白质高效胞内递送研究
近年来,基于蛋白质等生物大分子的研究得到了快速的发展。蛋白质药物具有特异性强、生物活性高等特点,在疾病治疗中发挥出巨大的作用。然而,目前临床使用的蛋白质药物都是针对细胞外靶点开发的,无法直接参与细胞内进行的生化反应。因此,作用于胞内靶点的蛋白质药物具有非常广阔的应用前景。针对天然蛋白难以渗透细胞膜进入胞内发挥作用的问题,研究人员开发了一系列无机纳米颗粒、脂质体、聚合物载体等蛋白质胞内递送系统。其中聚合物载体具有合成简易、易于修饰等特点,成为最具优势的蛋白质胞内递送载体之一。利用载体胞内高效递送蛋白质,关键在于解决载体胞内递送蛋白质面临的挑战:蛋白质与载体稳定结合、蛋白质与载体复合物的高效内吞、溶酶体逃逸以及蛋白质的胞内高效释放等。本论文针对上述关键问题开发了三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)修饰的蛋白质前药,分别设计了胍基和胸苷基团修饰的阳离子聚合物,利用蛋白质前药和载体之间的多重作用力解决了蛋白质与阳离子聚合物无法稳定结合的问题;同时由于蛋白质前药的pH响应性,蛋白质在内涵体酸性环境中无痕释放,从而实现蛋白质的高效胞内递送。第一章介绍了蛋白质药物的概况和应用、蛋白质胞内递送的意义、阳离子聚合物载体递送蛋白质的挑战、蛋白质负电化策略和功能化阳离子聚合物用于蛋白质的胞内递送。第二章发展了一种绿色、快速且安全的蛋白质前药修饰策略,实现蛋白质负电化,并利用胍基修饰的α-螺旋阳离子聚多肽LPP实现蛋白质前药的高效胞内递送及胞内蛋白质无痕释放。一方面,基于生物正交化学的方法,首先利用2-乙酰基苯硼酸(2-acetylphenylboronicacid,ABA)与蛋白质上赖氨酸残基反应形成具有pH响应的“席夫碱”结构,然后ATP通过与ABA形成硼酸酯修饰到蛋白质表面,制成磷酸腺苷化蛋白A-protein。另一方面,通过点击化学反应将胍基修饰到α-螺旋结构的聚多肽主链上得到LPP。通过负电化的蛋白质与阳离子载体的静电作用,蛋白质表面的磷酸基团与载体上胍基间的氢键和盐桥作用,蛋白质前药与载体结合形成稳定的纳米复合物(nanocomplexes,NCs),从而实现了蛋白质高效胞内递送。在细胞内内涵体/溶酶体的酸性环境中,“席夫碱”Microscopy immunoelectron断裂,NCs发生解离,释放蛋白质并恢复活性。该蛋白质递送平台介导了多种不同分子量(12.4-430kDa)和等电点(4.5-10.3)的蛋白质的胞内递送,包括酶、毒素蛋白和抗体等。同时,该策略也高效地将成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated 9,CRISPR-Cas9)核糖核酸蛋白(ribonucleoproteins,RNPs)递送至 293T-EGFP 及 HeLa 细胞中,实现了对增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein,EGFP)和 polo 样激酶 l(polo-like kselleck激酶抑制剂inase 1,PLK1)的基因敲除。第三章发展了一种胸苷化的阳离子聚合物载体PEI-AZT,其可通过碱基配对增强与第一章中发展的磷酸腺苷化蛋白质A-protein的稳定结合,实现蛋白质的高效胞内递送及胞内蛋白质无痕释放。通过点击化学反应将叠氮胸苷(azidothymidine,AZT)修饰到阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)上,制成胸苷化的阳离子聚合物PEI-AZT。PEI-AZT与A-protein间通过静电作用和碱基配对间的氢键作用可形成稳定的NCs。其可实现牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、核糖核酸Rapamycin分子量酶 A(ribonuclease A,RNase A)、细胞色素 C(cytochrome C,Cyt C)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)等不同分子量和等电点的蛋白质的高效胞内递送,并成功递送了 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)这类高分子量的蛋白质。在细胞内涵体/溶酶体的酸性环境中,蛋白质前药中的“席夫碱”断裂,NCs解离,释放包载的蛋白质并顺利恢复其活性。该策略能够将蛋白质递送到正常细胞系(NIH-3T3、H9C2)和肿瘤细胞系(HeLa、A549)中,是一种稳定且普适的蛋白质胞内递送平台。第四章对本文中胞内蛋白递送体系进行了总结,并对后续拟开展的工作做出展望。