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姜酚是姜(Zingiber officinale Rose.)中主要活性成分,课题组前期研究结果表明炮姜在炮制过程中姜酚类成分含量明显降低,其中,6-姜酚的含量降低在15%～42%之间,而姜烯酚类的含量则显著升高,且在炮制过程中会有新成分姜酮的产生,这表明,干姜炮制成炮姜后,姜酚类成分的“质”和“量”发生了转变。但是,炮制对炮姜姜酚类成分的转化规律及其活性影响等尚不完全明确,值得进一步研究。目的:明确炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律,为炮姜的炮制工艺和炮制机理提供参考;探讨转化产物6-姜烯酚、姜酮与原型成分6-姜酚对HUVEC的保护作用及机制,为转化后药效变化的内在机理提供依据。方法:1.炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律及抗氧化活性变化研究采用UPLC法测定干姜和不同砂烫工艺炮姜样品中的6-姜烯酚、姜酮和6-姜酚含量;采用油浴加热模拟炮制6-姜酚单体,考察不同时间、温度条件下6-姜酚及其转化产物的含量变化规律;测定不同砂烫工艺炮姜样品及6-姜酚模拟炮制产物的体外抗氧化活性,并采用SPSS 23.0进行6-姜酚含量与抗氧化活性之间的相关性分析Smoothened Agonist分子量。2.基于网络药理学探讨6-姜酚及其转化产物改善血管内皮损伤的作用机制通过Swiss Target Prediction数据库、Pharm Mapper数据库获取转化产物6-姜烯酚、姜酮和early response biomarkers原型成分6-姜酚的成分靶点,通过Gene Cards数据库获取血管内皮损伤靶点,采用Venn网站筛选三个成分靶点和血管内皮损伤靶点的交集靶点,通过STRING在线数据库对交集靶点构建PPI关系网络,通过DAVID数据对交集靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析,采用Cytoscape 3.8.0软件绘制“成分-靶点”相互作用网络图、PPI相互作用网络图及“成分-靶点-通路”网络互作图并进行拓扑分析。3.6-姜酚及其转化产物通过PI3K-AKT-NRF2通路调控铁死亡改善LPS诱导的HUVEC损伤实验分为正常组、LPS模型组、LPS+6-姜烯酚组、LPS+姜酮组、LPS+6-姜酚组。采用CCK8法检测各组细胞活力,采用Hoechst 33258染色观察各组细胞凋亡情况,采用ELISA及亚铁嗪微板法测定各组IL-1β、TNF-α、ROS、MDA、SOD、GSH和Iron表达水平,通过q RT-PCR对各组HUVEC相关基因表达水平进行检测,通过Western Blot检测HUVEC相关蛋白的表达。结果:1.炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律及抗氧化活性变化研究随着砂烫时间的延长和温度的升高,炮姜样品中6-姜烯酚和姜酮的含量逐渐升高,6-姜酚的含量逐渐下降;模拟炮制确认了6-姜酚经油浴加热后会部分转化为6-姜烯酚和姜酮;炮姜和6-姜酚模拟炮制样品中6-姜酚含量与抗氧化活性之间存在显著正相关。2.基于网络药理学探讨6-姜酚及其转化产物改善血管内皮损伤的作用机制通过相关数据库的筛选,得到3个成分靶点共255个,血管内皮损伤靶点986个,交集靶点172个,Cytoscape 3.8.0软件拓扑分析筛选出包括SRC、PIK3R1、PIK3CA、GRB2、HSP90AA1等10个关键靶点,GO富集分析和KEGG富集通路的结果发现转化产物6-姜烯酚、姜酮和原型成分6-姜酚的血管内皮保护作用主要涉及细胞迁移的正向调节、细胞凋亡过程的负向调节、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的正向调节、细胞增殖正向调节等,3者作用于PI3K-AKT信号通路,调控其下游的靶基因和靶蛋白,结合文献分析,推测6-姜烯酚、姜酮和6-姜酚对血管内皮的保护作用可能与通过PI3K-AKT信号通路及下游NRF2/HO-1途径调控铁死亡相关。3.6-姜酚及其转化产物通过PI3K-AKT-NRF2通路调控铁死亡改善LPS诱导的HUVEC损伤。结果表明,LPS造模后,与正常组相比,细胞活力会显著下降,细胞形态会发生改变,且细胞核出现破裂等现象,而LPS+6-姜烯酚、LPS+姜酮和LPS+6-姜酚给药组细胞活力会显著升高,细胞形态也有明显的改善。ELISA的结果显示LPS模型组能够增加IL-1β、TNF-α、ROS、MDA、Iron等指标水平的表达,降低SOD和GSH的表达水平,q RT-PCR结果表明LPS模型组能够上调PI3K、AKT、NRF2等通路基因的表达水平,上调促进细胞凋亡的Bax/Bcl-2基因表达量比值,下调铁死亡负调控基因GPX4、SLC7A11的表达量,Western Blot结果表明各组的PI3K、AKT表达量无明显差异,但LPS模型组能够显著降低p-PI3K、p-AKT,其余指标与q RT-PCR结果一致,而LPS+6-姜烯酚、LPNSC 127716 molecular weightS+姜酮和LPS+6-姜酚给药组能够逆转以上趋势。结论:1本课题通过模拟炮制结合体外抗氧化的方法明确了炮姜炮制过程中6-姜酚会转化为6-姜烯酚和姜酮,随着砂烫时间的延长和温度的升高,6-姜烯酚和姜酮的含量逐渐升高,6-姜酚的含量逐渐下降,且6-姜酚含量与抗氧化活性之间存在显著正相关。2在文献分析的基础上,通过网络药理学结合体外细胞验证,明确了转化产物6-姜烯酚、姜酮和原型成分6-姜酚通过激活PI3K-AKT-NRF2通路抑制铁死亡改善LPS所致的HUVEC氧化应激损伤。

目的以自发突变导致的小头、震颤(microcephaly and seCardiovascular biologyizure,mise)斑马鱼为模型,研究其遗传方式,突变基因定位及初步的表型分析。方法通过比较正常和突变体斑马鱼的头宽和眼球面积,鉴定突变体的小头小眼性状;通过构建家系确定突变遗传方式。对极端表型群体进行基因组重测序,随后利用分离群体分组分析(bulked segregation analysis,BSA)和竞争性等位基因特异性PCR (competitive allele sBelnacasan纯度pecific PCR,KASP),一代测序Tezacaftor等方法获得突变基因定位。结果与野生型相比,突变体mise受精后3 d (3 days post fertilization,3 dpf)表现为小头小眼震颤表型。经基因定位及验证明确与表型相关的突变基因为terfa。结论本研究通过全基因组重测序结合连锁分析的方法快速定位突变基因,可为斑马鱼突变体的基因定位提供参考,为神经系统发育异常的相关基因功能分析奠定基础。

背景与目的:肾癌是人类泌尿系统中常见的恶性肿瘤,其发生率仅次于前列腺癌和膀胱癌,而肾癌在近年来的发病率正呈现逐渐增加态势,对人们的生活健康带来了巨大的威胁。按照病理学分类,肾细胞癌中,肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)是最主要的组织学亚型。目前,肾癌的治疗方式主要是依靠手术切除,尽管随着针对晚期肾癌selleckchem Pexidartinib患者的分子免疫治疗和靶向治疗的迅速发展,为许多晚期肾癌的患者带来了临床治疗的希望,但晚期肾癌的5年生存率仍然不尽人意。肾癌的早期临床表现往往不明显,大多数病人就诊时就已经进入中晚期,所以我们急需更加高效新颖的检测手段以提高肾癌的检测准确率。近些年来,与肿瘤铁死亡相关的研究日益增多,铁死亡与细胞凋亡、坏死和自噬等其他形式的细胞死亡不同,它是一种新的程序性细胞死亡,其主要特征在于铁依赖性的细胞内脂质性的活性氧物质累积。随着人们对铁死亡的不断研究,人们已经确定铁死亡在杀死肿瘤细胞以及抑制肿瘤细胞的生长方面起着十分关键的作用,而且有证据表明肾癌与铁死亡关系密切,铁死亡可通过多种免疫细胞和免疫因子对肿瘤细胞产生影响,并且铁死亡在肾透明细胞癌的肿瘤细胞清除中发挥着重要的作用,不过其作用机制尚未阐明,我们需要通过进一步研究来揭示其在肾透明细胞癌的治疗和预后中的重要意义。我们筛选出与肾透明细胞癌预后密切相关的铁死亡预后相关基因法尼基-二磷酸法尼基转移酶1(farnesyldiphosphate farnesyltransferase,FDFT1),并通过体外试验验证他们在肾透明细胞癌中的作用。收集肾透明细胞癌标本,进一步验证FDFT1在肾透明细胞癌患者中的表达情况。方法:本研究通过癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)下载了肾透明细胞癌细胞的相关测序数据集与检索所得的铁死亡相关基因之间取交集,进行铁死亡有关基因的差异表达基因分析。并采用单因repeat biopsy素Cox回归模型分析铁死亡相关基因,筛选出与肾透明细胞癌预后密切相关的铁死亡预后相关基因FDFT1,通过生物信息学方法及质粒转染技术分析并检测FDFT1在786-O细胞中的功能。收集肾透明细胞癌患者的肿瘤组织样本及其癌旁组织,通过实时定量聚合酶链反应、蛋白质印迹分析FDFT1基因的表达情况进行验证。结CCRG 81045化学结构果:1.铁死亡相关基因的差异分析得到44个铁死亡相关的差异表达基因,单因素Cox回归模型分析得到34个与肾透明细胞癌预后相关的基因,两者之间取交集得到22个预后铁死亡相关基因。2.京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway,KEGG)通路分析和基因本体学(Gene Ontology,GO)功能富集分析表明预后铁死亡相关基因的生物学分类在生物过程方面富集在硫化合物生物合成过程、羧酸生物合成过程、有机酸生物合成过程和硫化合物代谢过程中。枢纽基因和生存分析显示FDFT1的高表达与更好的总生存期和无病生存期显著相关,FDFT1可能对肿瘤的生长具有抑制作用。3.Western印迹和q PCR显示FDFT1在KIRC细胞系786-O中表达下调,FDFT1过表达,可以下调铁死亡生物标志物谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的蛋白质和m RNA水平,且蛋白质印迹显示,当FDFT1水平上调可导致蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)的表达水平下降。4.FDFT1的过表达可以明显抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并且蛋白印迹和q RT-PCR显示FDFT1在肾透明细胞癌组织中的表达低于正常组织的表达水平。结论:我们的研究显示,FDFT1在肾透明细胞癌细胞中较正常肾脏组织相比呈现更低的表达水平,并且FDFT1的表达上调能够有助于抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

研究背景:青光眼为全球首位不可逆性致盲眼病,是一组以进行性视神经损伤,视野缺损为重要特征的视神经疾病,病理性眼压升高为其重要的危险因素。目前,治疗青光眼唯一具有循证医学证据的方式是降低患者眼压,其中,外滤过手术是降眼压最为有效的手术方法之一,但术后瘢痕化仍是影响手术成功率的最重要因素。尽管丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)等抗代谢药物的临床应用能一定程度上提高手术成功率,然而其药物毒性作用常引起严重的并发症,并且即使在使用抗代谢药物情况下依然有部分患者预后不佳。因此,外滤过手术后的瘢痕化是始终困扰青光眼医生的一个亟待解决的问题。青光眼外滤过手术后的伤口愈合涉及到一系列复杂和动态的级联过程,包括止血期、炎症期、增殖期和组织重塑期,多种细胞因子和生长因子可参与到该过程中。其中,白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)作为一种重要的炎症介质,可在炎症期被大量释放;且以往已经有大量研究表明,IL-6能够诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞参与纤维化的形成。转化生长因子β(Transforming growth factor,TGF-β)同样是一种重要的促纤维化因子,在伤口愈合的增殖期可刺激人Tenon囊成纤维细胞(Human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)迁移、增殖、细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成和向肌成纤维细胞表型转化。信号转导及转录激活蛋白3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一种重要的核转录因子,可在多种细胞因子和生长因子的刺激下发生磷酸化而被激活,磷酸化的STAT3蛋白形成二聚体,随后进入核内与DNA结合,并最终调节靶基因的转录。在生理状态下,STAT3的信号转导受细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的负反馈调控。据文献报道,STAT3在调节细胞生长、分化和存活方面发挥重要作用,并且能参与免疫应答和炎症等多种生物学过程。由于激活STAT3的许多细胞因子以及生长因子可诱导纤维化的发生,同时STAT3调节的众多生物学过程诸如细胞生长、分化、存活以及炎症等在瘢痕形成过程中发挥重要作用。因此,我们推测STAT3很可能是促纤维化作用的共同靶点。目前,尚没有关于STAT3在青光眼外滤过手术后瘢痕化中作用的相关研究。因此,本研究拟收集青光眼患者的结膜下组织,检测STAT3在人结膜下组织中的表达与激活情况,并提取和培养原代HTFs,分别利用TGF-β1和IL-6构建非炎症和炎症依赖途径诱导的体外HTFs纤维化模型,以探究STAT3在HTFs纤维化中的作用及机制。最后,构建SD大鼠青光眼外滤过手术模型,探究STAT3特异性抑制剂S3I-201对大鼠青光眼外滤过手术后结膜下组织瘢痕形成的影响。目的:探究STAT3在青光眼外滤过手术后瘢痕形成中的作用及其分子机制。方法:1.临床手术中收集青光眼患者的瘢痕化与非瘢痕化结膜下组织,其中,瘢痕化的结膜下组织来源于因滤过道瘢痕化眼压失控再次来我院手术的青光眼患者,非瘢痕化的结膜下组织来源于没有眼部手术史的青光眼患者。收集到的结膜下组织行冰冻切片以及免疫荧光染色检测P-STAT3和STAT3的表达Minimal associated pathological lesions情况。2.利用人结膜下组织提取HTFs,然后用TGF-β1和IL-6/s IL-6R体外诱导HTFs纤维化模型;通过Western Blot实验和细胞免疫荧光实验检测HTFs中PSTAT3和STAT3的表达情况。3.分别利用STAT3的特异性抑制剂S3I-201抑制STAT3激活以及STAT3si RNA敲低STAT3的基因表达水平;通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,Western Blot和细胞免疫荧光实验检测细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况,同时鬼笔环肽与α-SMA免疫荧光共染检测细胞应力纤维形成情况。4.利用TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导HTFs纤维化的同时在细胞培养基中加入S3I-201;通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞的迁移能力,Western Blot和细胞免疫荧光实验检测细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况,同时鬼笔环肽与α-SMA免疫荧光共染检测细胞应力纤维形成情况。5.利用TGF-β1和IL-6/s IL-6R分别培养HTFs后通过Western Blot实验检测SOCS3的表达水平;然后利用慢病毒感染HTFs过表达SOCS3,在LV-NC和LVSOCS3的HTFs培养基中再次分别加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R;通过CCK-8实验检测HTFs的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测HTFs的迁移能力,Western Blot实验检测HTFs的P-STAT3、STAT3、Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达情况。6.选取成年雄性SD大鼠构建青光眼外滤过手术模型。实验分为空白对照组(Control)、载体对照组(Vehicle)、MMC结膜下敷贴组(MMC)和S3I-201结膜下注射组(S3I-201)。分别于术前、术后3、7、14、21、28天测量大鼠眼压以及术后3、7、14、21、28天显微镜下观察大鼠眼球滤过泡形态并拍照。术后28天时处死大鼠并取眼球行组织冰冻切片和石蜡切片。通过TUNEL凋亡染色评估药物毒性情况;HE和Masson染色观察滤过道周围结膜下组织的病理学变化和胶原沉积情况;免疫荧光染色检测滤过道周围结膜下组织内Collagen-Ⅰ和Fibronectin的表达情况。结果:1.组织切片免疫荧光染色结果显示,STAT3在人结膜下组织中呈阳性表达。与非瘢痕化的结膜下组织相比,瘢痕化的结膜下组织中P-STAT3表达水平升高。2.Western Blot实验和细胞免疫荧光实验结果显示,STAT3在HTFs中有表达,并且在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的两种纤维化HTFs模型中,P-STAT3表达水平显著升高。免疫荧光实验结果显示激活后的P-STAT3定位于细胞核内。3.CCK-8实验结果显示,与对照组相比,S3I-201组以及STAT3 si RNA组中HTFs的增殖能力下降;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与对照组相比,S3I-201组以及STAT3 si RNA组中HTFs的迁移能力下降;Western Blot和细胞免疫荧光实验显示,与对照组相比,S3I-201组以及STPUN30119化学结构AT3 si RNA组中细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达水平下降,应力纤维形成减少。4.CCK-8实验结果显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的HTFs增殖能力增加,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的HTFs增殖;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的HTFs迁移能力增加,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的HTFs迁移;Western Blot和细胞免疫荧光实验显示,与对照组相比,TGF-β1和IL-6/s IL-6R处理组的细胞Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达水平升高,在TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的同时加入S3I-201,可抑制TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的Fibronectin、Collagen-I和α-SMA的表达,并且应力纤维形成减少。5.Western Blot实验结果显示,HTFs在TGF-β1和IL-6/s IL-6R作用下SOCS3表达水平下降。HTFs过表达SOCS3后,LV-NC和LV-SOCS3的培养基中分别加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R,CCK-8实验结果显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后HTFs的增殖能力下降;细胞划痕实验和Transwell小室实验显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后细胞迁移能力下降;Western Blot实验结果显示,与LV-NC组相比,LV-SOCS3组加入TGF-β1和IL-6/s IL-6R后细胞中P-STAT3、Fibronectin、CollagenI和α-SMA的表达水平下降。6.TUNEL凋亡实验结果显示,MMC组的大鼠滤过道周围结膜下组织区域可观察到大量TUNEL阳性细胞,而S3I-201组的结膜下组织中只发现少量的TUNEL阳性细胞。7.所有组动物在青光眼外滤过手术后第3天均观察到眼压较基线值眼压急剧下降。Vehicle组在术后第21天眼压开始回升,术后第28天眼压回升至基线水平。而S3I-201和MMC处理组的动物于术后第28天眼压开始出现回升,尽管S3I-201和MMC处理组的动物也表现出眼压升高,但是眼压升高的速度较Vehicle组慢。其中,S3I-201处理组在术后28天内眼压升高速度最慢。8.滤过泡生存分析表明,在青光眼外滤过手术后,Vehicle组的大鼠表现出滤过泡的快速消失,并且该组的滤过泡在第28天完全消失。与Vehicle组相比,MMC和S3I-201组的滤过泡存活时间明显更长。其中,MMC组在第14天滤过泡出现消失,第28天时滤过泡存活率为50%;而S3I-201组的滤过泡消失发生在第21天,第28天时滤过泡存活率为62.5%。9.HE染色和Masson染色结果显示,Control组可见结膜下组织结构疏松,其间可见少量成纤维细胞,胶原沉积少;Vehicle组术区结膜纤维层显著增厚,可见纤维结缔组织大量增生且排列紧密,炎症细胞和成纤维细胞增生,呈团块状生长且排列混乱,其间可见腺体及小血管增生,胶原沉积增多,呈致密或束状排列;MMC组相较于Vehicle组结膜下纤维层更为疏松,结膜下可见空洞形成,少量成纤维细胞增生,排列整齐,胶原沉积减少;S3I-201组纤维结缔组织结构疏松,可见空隙形成,成纤维细胞稀少,胶原沉积减少。组织切片免疫荧光染色显示,相较于Control组,Vehicle组手术区域的结膜下组织中Collagen-I和Fibronectin表达均升高;而与Vehicle组相比,MMC组和S3I-201组手术区域的结膜下组织中Collagen-I和Fibronectin表达均降低。结论:1.STAT3在人结膜下组织与HTFs中呈阳性表达,并且在瘢痕化的结膜下组织以及TGF-β1和IL-6/s IL-6R诱导的纤维化HTFs中被激活。2.STAT3可促进HTFs的增殖、迁移、ECM合成以及向肌成纤维细胞表型转化。3.STAT3可介导TGF-β1非炎症依赖途径selleckchem RP56976和IL-6炎症依赖途径所诱导的HTFs纤维化,是TGF-β1和IL-6促纤维化作用的共同靶点。4.TGF-β1和IL-6可通过降低SOCS3的表达水平,激活STAT3的信号通路促进HTFs纤维化。5.STAT3的特异性抑制剂S3I-201可减轻大鼠外滤过手术后的结膜下组织胶原沉积,延长低眼压维持时间和滤过泡存活时间;并且与MMC相比,S3I-201对眼组织毒性作用更小。

全/多卤代有机污染物大多具有生态毒性、生物蓄积性、环境持久性及长距离迁移性，不仅危害环境与生态安全，而且可经食物链传递威胁人类健康。由于卤原子是吸电子基团且取代数目多，这类物质的最高占据分子轨道能较低，难于被氧化降解，相反较易被还原法脱卤降解。随卤原子取代数减少，脱卤产物难被进一步还原，而其毒性selleckchem甚至高于母体污染物。注意到低卤代有机物更容易发生氧化降解，一些研究构建了还原-氧化接力降解Taurine体外体系，即先利用还原法将全/多卤代有机污染物还原为低卤代产物，再利Core-needle biopsy用氧化法降解这些中间产物，从而实现深度/完全脱卤和矿化。本文根据催化反应类型对还原-氧化联用法进行了归纳，分类介绍了基于传统化学催化、光催化、电化学、光电化学及机械化学等构建还原-氧化协同降解体系的原理及应用，以期为开发高效的处置技术提供思路和建议。

研究背景:1.化疗抵抗是影响胃癌预后的重要原因2020年世界卫生组织发表数据显示:胃癌是世界范围内第五大常见恶性肿瘤和第四大恶性肿瘤相关死亡原因。目前,以化疗为主的综合治疗是主要治疗手段,然而胃癌患者的5年生存率仍低于30%,化疗LXH254生产商抵抗可能是重要影响因素。因此,探索化疗抵抗的关键机制,并寻求有效的应对药物是当前工作的重中之重。2.衰老肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)促进胃癌化疗抵抗形成,M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)与免疫抑制和化疗抵抗密切相关CAFs是肿瘤微环境中最主要的基质细胞。研究表明,化疗在杀伤癌细胞的同时,可以引发CAFs发生衰老,所产生的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)可以促进化疗抵抗的发生。TAMs是肿瘤微环境中重要的免疫细胞,在肿瘤早期以抑瘤作用的M1型为主,中晚期以促瘤作用的M2型为主。最新报道,M2型TAMs具有免疫抑制以及促进化疗抵抗的作用。那么,肿瘤微环境中各种细胞相互作用、互相影响,衰老CAFs是否可以促进TAMs细胞向M2型极化,从而增强免疫抑制?这一问题有待研究。3.扶正解毒方是提高胃癌化疗疗效的有效方剂,其机制需要进一步明确扶正解毒方(后研发为院内扶正解毒口服液)是我院肿瘤科用于治疗胃癌的院内制剂。前期研究显示,扶正解毒方可以增加化疗完成率,使胃癌Ⅲ期患者的5年生存率提高9.1%。另动物实验表明,扶正解毒方联合化疗干预胃癌模型小鼠,治疗效果显著优于单纯化疗组,其机制可能与调控肿瘤微环境中TAMs从M2型向M1型极化,降低免疫抑制因子IL-10、此网站IL-13和TGF-β的表达有关。然而,扶正解毒方是否可以通过调控衰老CAFs改善免疫抑制和化疗抵抗尚待明确。综上,本课题从“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”入手,探讨衰老CAFs引起免疫抑制和化疗抵抗的新机制,以及扶正解毒方的干预作用,旨在为临床上解决胃癌化疗抵抗这一瓶颈问题提供助力。研究目的:1.体外借助衰老CAFs细胞模型,基于p38MAPK/MK2通路和MeCP2/NOX4/PKM2通路,观察衰老CAFs对免疫抑制以及化疗抵抗的促进作用,以及扶正解毒方的干预机制。2.体内借助衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型,验证扶正解毒方通过调控“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”,改善免疫抑制和化疗抵抗的作用机制。研究方法:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究应用团队前期构建的衰老CAFs模型,采用MRC-5人胚肺成纤维细胞,设置对照组、衰老CAFs模型组、空白血清组、含药血清组,运用ELISA、RT-PCR以及免疫荧光技术,对SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B进行检测,同时观察扶正解毒方含药血清的干预作用。2.衰老 CAFs 条件培养基(conditioned medium,CM)诱导 M2 型 TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究运用PMA将THP-1人单核细胞诱导为TAMs细胞;按照团队前期探索的方法提取衰老CAFs的CM,并用其培养TAMs细胞,设置对照组、衰老CAFs-CM组、空白血清组、含药血清组,借助流式细胞术、RT-PCR、免疫荧光技术,检测M2型TAMs细胞标志物CD206的表达水平;同时观察扶正解毒方含药血清对M2型TAMs极化的干预作用;另基于p38MAPK/MK2通路,运用RT-PCR、Western blot方法对作用机制进行探讨。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究应用衰老CAFs的CM培养MKN-45胃癌细胞,设置对照组、化疗组、衰老CAFs-CM组、衰老CAFs-CM+化疗组、空白血清组、含药血清组,通过CCK-8法、细胞划痕、平板细胞克隆等实验探讨衰老CAFs-CM对胃癌细胞化疗敏感性的影响;并观察扶正解毒方对衰老CAFs-CM引起化疗抵抗的干预作用。在此基础上,利用RT-PCR、Western blot等方法,基于MeCP2/NOX4/PKM2通路探讨扶正解毒方发挥作用的机制。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究采用25只CB17-SCID免疫缺陷小鼠,分别单纯接种胃癌细胞、混合接种衰老CAFs/胃癌细胞,给予5-FU和(或)扶正解毒方进行干预。具体分组为对照组、5-FU组、混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组,干预14天后取材,检测以下指标:(1)小鼠瘤重、瘤体积、抑瘤率;运用RT-PCR、Western blot方法,检测MeCP2/NOX4/PKM2通路的mRNA和蛋白表达水平。(2)运用ELISA、RT-PCR方法,检测小鼠血清和瘤组织中衰老相关分泌因子IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平。(3)运用流式细胞术、免疫荧光方法,检测小鼠脾脏和瘤组织中M2型TAMs表达情况。结合RT-PCR、Western blot方法,检测p38MAPK/MK2通路mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究ELISA、RT-PCR、免疫荧光结果显示:(1)与对照组相比,衰老CAFs组SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs高表达SASP因子。(2)与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以明显抑制衰老CAFs细胞SASP相关因子—TGF-β、WNT16B的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,虽然含药血清组的IL-8表达水平低于空白血清组,但无统计学差异(P>0.05),说明扶正解毒方含药血清可以降低SASP因子的表达水平。2.衰老CAFs-CM诱导M2型TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR结果显示:①与对照组相比,衰老CAFs-CM组的M2型TAMs细胞标志物CD206处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs可以诱导TAMs细胞向M2型极化,增强免疫抑制。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低CD206的表达水平(P<0.05),逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低p38MAPK、MK2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究(1)CCK-8实验、平板细胞克隆形成实验、划痕实验结果显示:①与5-FU组相比,衰老CAFs-CM+5-FU组的肿瘤细胞抑制率明显降低、肿瘤细胞克隆数明显增多、肿瘤细胞迁移率明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs降低了化疗药5-FU的治疗效果,促进了化疗抵抗形成。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以提高肿瘤细胞抑制率、减少肿瘤细胞克隆数、降低肿瘤细胞迁移率,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方可以缓解由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低MeCP2、NOX4、PKM2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究4.1衰老CAFs对化疗敏感性的影响及扶正解毒方干预作用研究(1)瘤重、瘤体积、抑瘤率结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞各组(对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组)的瘤重、瘤体积明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs具有促瘤作用。②相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”的瘤重、瘤体积Bioassay-guided isolation明显增大(P<0.05,差异有统计学意义),抑瘤率明显下降,说明衰老CAFs可以引起化疗抵抗。③与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤重和瘤体积明显变小(P<0.05,差异有统计学意义)、抑瘤率显著提高,差异具有统计学意义,提示扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中MeCP2、NOX4、PKM2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.2 SASP相关因子检测及扶正解毒方干预作用研究ELISA和RT-PCR结果显示:(1)在小鼠血清中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”TGF-β、IL-8处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在小鼠瘤组织中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”IL-8、TGF-β、WNT16B均处于高表达水平(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内SASP因子处于高表达水平。(2)与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的血清和瘤组织中IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的SASP高表达。4.3 M2型TAMs表达情况及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术和免疫荧光结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞组(即对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组)小鼠脾脏中CD206的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内M2型TAMs细胞表达水平明显升高,增强免疫抑制。②与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的脾脏和瘤组织中CD206明显降低(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中p38MAPK和MK2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。研究结论:1.衰老CAFs存在衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)高表达;扶正解毒方可下调衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)的表达。2.衰老CAFs可以引起TAMs细胞高表达CD206,促进其向M2型TAMs细胞极化,增强免疫抑制;扶正解毒方可降低TAMs细胞CD206的表达水平,改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制,其机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs可降低胃癌细胞对化疗药物5-FU的治疗效果,促进化疗抵抗形成;扶正解毒方可改善由衰老CAFs引起的胃癌细胞对5-FU的化疗抵抗,其机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关综上,扶正解毒方可以通过对肿瘤微环境中“衰老CAFs-TAMs细胞-胃癌细胞”发挥调控作用,改善免疫抑制以及化疗抵抗。

目的 探讨两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物（ABCD）治疗恶性血液病合并侵袭性真菌病（IFD）的疗效及安全性。方法 回顾性分析2021年6月至2022年7月就诊于南方医科大学南方医院血液科的34例恶性血液病合并IFD患者应用ABBiomass distributionCD的疗效及不良反应。结果 34例恶性血液病患者，白血病28例（82.4%），骨髓增生异常综合征4例（11.8%），淋巴瘤2例（5.9%）；其中异基因造血干细胞移植13例。31例诊断肺部真菌感染，6例合并其他部位真菌感染。8例采用高通量测序技术（NGS）检测到真菌病原体，其中仅3例血培养显示阳性，提示NGS在诊断中具有BI 10773研究购买较好Dinaciclib抑制剂的灵敏度和特异度。随访时间97.5(6.0～121.0)d，疗效评判有效22例，无效12例，总有效率64.7%，有效组与无效组对比，患者的原发病缓解情况差异具有统计学意义（P=0.001），患者是否接受移植、粒细胞缺乏程度、持续时间等差异无统计学意义（P>0.05）。30 d、100 d累积生存率分别为79%、71%。31例（91.2%）出现输液相关反应（IRRs），最常见为发热（93.5%）和寒战（35.5%）。7例（20.6%）发生肾功能损害，减停药物后好转。18例（52.9%）发生低钾血症，血钾水平2.95(2.34～3.38)mmol/L。结论 ABCD在治疗恶性血液病合并侵袭性真菌病中有较好的疗效，且毒副反应小，早期应用患者获益可能更大。

目的 观察温肾通络止痛PLX-4720分子式方对巨噬细胞极化的作用，探讨其对破骨细胞分化的影响。方法 利用脂多糖建立炎性巨噬细胞模型，小鼠骨髓单核细胞体外建立破骨细胞诱导模型。通过CCK8法检测不同浓度温肾通络止痛方冻干粉对巨噬细胞增殖的影响。将实验分为正常组、模型组、中药组，通过ELISA检测巨噬细胞培养基上清中IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10的表达，利用蛋白免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白及INOS、TNF-α蛋白的表达。采用TRAP染色及F-actin免疫荧光检测温肾通络止痛方对破骨细胞分化的影响。结果 CCK8结果显示温肾通络止痛方冻干粉48h 125μg/mL对巨噬细胞的增selleck产品殖效果最好(P<0.01)。酶联免疫法检测结果表明，与正常组比较，模型组巨噬细胞上清液中IL-6、TNF-α的表达升高，IL-10、TGF-β的表达降低；经温肾通络止痛方干预后IL-6、TNF-α的表达降低，IL-10、TGF-β的表达升高，且各组间差异具有统计学意义(P<0.01)。蛋白免疫印迹法结果表明，与正常组比较，模型组中p-p65/p65、TNF-α、INOS蛋白表达升高(P<0.01),IκBα的表达降低(P<0.01),与模型组比较，中药组中p-p65/p65、TNFα(P<0.01)、INOS(P<0.01)的蛋白表达降低，IκBα的表达升高(P<0.05)。TRAP和F-actin检测结果显示，各中药组均能减少破骨细胞数目，减小F-actin环面积，并减少环的数目，且各组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 温肾通络止痛Multiple markers of viral infections方可能通过抑制NF-κB信号通路的相关蛋白的表达，抑制巨噬细胞M1极化，从而抑制破骨细胞的分化。

为了了解茉莉酸(jasmonic acid, JA)信号途径基因在水稻愈伤组织诱导和分化过程中的作用，本研究对转录因子基因OsMYC2在水稻再生过程中的功能进行了研究。利用qRT-PCR技术对OsMYC2基因在水稻愈伤诱导和分化过程中的表达进行动态分析，BI 10773体内同时对osmyc2基因编辑突变Cellular immune response体在水稻组织培养再生过程中的表型进行鉴定，并对osmyc2突变体愈伤中的一些重要标记基因的表达进行调查和分析。qRT-PCR基因表达鉴定结果显示，OsMYC2基因在水稻成熟胚愈伤组织诱导和分化过程中均存在一定量的表达，且在分化期的表达量相对较高。而osmyc2突变体的愈伤诱导效率和分化效率均显著低于野生型对照日本晴。同时，基因表达分析发现，OsERF101、OsBBM2和OsWUS等与再生相关的重要基因在osmyc2突变体愈伤中的表达与野生型对照相比均显著下降。由此表明，OsMYC2基因可能通过茉莉酸信号途径影响水稻成熟胚愈伤组织的诱导形成和胚性愈伤的分化。该研究对OsMYC2在水稻再生过程中的作用进行了探索性研究，为未来深入研究茉莉酸信号途径影MK-1775细胞培养响水稻组织培养的分子机制提供了一定的理论基础。

水稻作为重要的粮食作物,其胚乳是最主要的食用部位。灌浆期的水稻胚乳由外向内依次包括糊粉层、亚糊粉层和淀粉胚乳三部分。其中糊粉层含有丰富的脂肪酸、维生素和微量元素,近来已提出通过增加糊粉层厚度改良谷物的营养品质。但是目前关于水稻糊粉层发育的分子机制还知之甚少,制约了这一策略在稻米营养品质改良中的应用。VP1(Viviparous 1)是B3转录因子家族的一个成员,是ABA(脱落酸)信号的重要调节因子,参与种子休眠。本研究发现OsVP1主要在水稻籽粒的糊粉层和胚中表达,除了参与水稻休眠调控,还会影响糊粉层发育。研究结果表明:与野生型相比,osvp1突变体有明显的穗发芽现象,同时糊粉层增厚。此外,本研究还分析了水稻另外两个B3转录因子PHS-B3a和PHS-B3b,研究发现它们突变后在高温高湿的环境下均会产生穗发芽现象。本研究的主要结果如下:1.OsVP1表达模式分析:通过荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)实验,我们检测了 OsVP1在不同组织以及受精后不同天数颖果中的表达,结果显示,营养器官中几乎检测不到OsVP1的表达;OsVP1在花后10天的发育颖果中开始表达,并在颖果发育后期持续高表达。对pOsVP1::GUS转基因植株的GUS染色结果显示:从10DAF(授粉后天数)开始,OsVP1主要在颖果背部糊粉层表达。2.利用CRISPR/Cas9技术成功构建了osvp1靶向突变体,并对突变体进行表型分析,发现与野生型相比,osvp1突变体具有明显的穗发芽现象。此外,osvp1突变体籽粒的背部糊粉层明显增厚。进一步对p1301Ubi-OsVP1-eGFP过表达转基因材料的考察发现,与野生型相比,OsVP1过表达系籽粒背部糊粉层厚度显著变薄,表明OsVP1参与水稻糊粉层发育的调控。3.糊粉层树脂切片结果显示,野生型和突变体糊粉层厚度差异主要是在籽粒背部,统计结果表明野生型仅有3-5层细胞,而突变体有4-7层细胞;其腹部糊粉层厚度没有差异。透射电镜观察发现,相比野生型,突变体的糊粉层变厚,且蛋白体增多,暗示着OsVP1可能参与了糊粉层分化。4.为了深入了解OsVP1调控水稻糊粉层发育的机制,本研究对野生型和突变体10DAF的糊粉层进行了转录组测序。结果显示,与野生型相比,在两个突变体中共检测到2479个差异表达基因,其中1422个基因表达上调,1057个基因表达下调;GO富集分析graft infection表明糊粉粒膜、泛素连接酶复合物等相关基因显著富集。KEGG分析发现这些差异表达基因主要参与光合作用、植物信号转导、谷胱甘肽代谢、糖酵解以及淀粉蔗糖代谢等一些重要代谢通路。其中,多个生长素相关基因在野生型和osvp1突变体中的表达发生了显著变化;此外,糊粉层特异表达基因OsNF-YB1在osvp1突变体中的表达下降。5.通过比较糊粉层发育关键调控基因在野生型和osvp1中的表达,我们发现TWINKLE、OsDEK1、OsROS1a和RISBZ1在osvp1突变体中的表达都有所下调;至于Os VP1是否通过调控上述基因以参与糊粉层的发育还有待研究。6.本课题组前期发现PRC2基因OsFIE1也参与糊粉层的SB431542生产商调控,osfie1突变体糊粉层较野生型显著增厚。进一步构建osfie1 osvp1双突,发现双突变体种子糊粉层较单突变体厚度显著增加。考虑到OsFIE1调控糊粉层厚度与赤霉素(GA)相关,于是在野生型和osvp1突变体始花期,我们利用GA处理其稻穗至花后30天。结果显示处理前后糊粉层厚度无显著差异,暗示OsVP1和OsFIE1调控糊粉层的发育可能不在同一个通路上。此外酵母双杂交以及荧光素酶互补等实验也显示二者并不存在互作。7.此外,我们还利用CRISPR/Cas9技术敲除了水稻B3转录因子家PLX5622 IC50族的另外两个基因PHS-B3a和PHS-B3b。对两者突变体的表型分析结果显示,这两个基因突变后不会影响糊粉层的发育;但在高温高湿的环境下均会表现出穗发芽的表型。