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目的 分析良性前列腺增生(BPH)患者经尿道等离子前列腺剜除术(TPKEP)后发生急性附睾-睾丸炎的影响因素，并建立个体化风险模型。方法 回顾性分析300例行TPKEP的BPH患者的临床资料，根据术后是否发生急性附睾-睾丸炎将患者分为并发组与非并发组。比较两组患者的临床资料，并采用多因素Logistic回归模型分析BPH患者TPKEP后发生急性附睾-睾丸炎的影响因素。基于影响因素构建列线图风险模型，通过受试者工作特征曲线及校正曲线评价该GPCR & G Protein抑制剂模型的准确性。结果 两组患者年龄、糖尿病史、手术PUN30119 NMR时间、术后留置导尿管时间比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示，年龄、糖尿病史、手术时间、术后留置尿管时间均是BPH患者TPKEP后发生急性附睾-睾丸炎的影响因素(均P<0.05)。基于上述影响因素建立Institutes of Medicine的列线图风险模型的受试者工作特征曲线下面积为0.817,校正曲线显示该模型的预测可能性绝对误差为0.012。结论 年龄>65岁、合并糖尿病、手术时间>90 min、术后留置导尿管时间>5 d的BPH患者TPKEP后发生急性附睾-睾丸炎的风险增加。基于上述影响因素建立的列线图风险模型对BPH患者TPKEP后急性附睾-睾丸炎的发生风险具有较好的评估价值。

一、研究背景淹溺是意外伤害导致死亡的第三位原因。在过去的十年中,淹溺导致了超过250万人死亡。不同国家和地区海水淹溺的比例存在差异,而且随着滨海旅游、海上作业等活动的增加,以及海洋国防事业的需求,海水淹溺人数可能会继续增加。肺脏是海水淹溺时容易受损的靶器官,1/3的非致命性淹溺患者会出现急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或者急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的诊断标准,这也被称为海水吸入诱导急性肺损伤(seawater aspiration induced acute lung injury,SW-ALI)。ALI/ARDS一种严重威胁生命的临床综合征,其特点是顽固性低氧性呼吸衰竭和胸部影像学上的双肺弥散性渗出。在ALI/ARDS进程中,肺泡上皮-血管内皮屏障功能的破坏,最终导致富含蛋白质的液体渗出到肺泡腔和肺泡间隙中。目前,尚无针对ALI/ARDS的有效药物治疗方案,主要采取机械通气、俯卧位、体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)、糖皮质激素等支持治疗。基于间充质干细胞的疗法是治疗ALI/ARDS有前景的疗法。临床前研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)可以有效减轻动物模型的肺损伤。但是,MSC的致瘤性、免疫原性、低移植率等问题限制了其应用。间充质干细胞来源的外泌体(MSC derived exosome,MSC-Exo)是由MSC分泌的一种细胞囊泡,继承了MSC的功能,而且具有更要的药代动力学。可能通过传递生物活性物质,发挥调节炎症信号通路、促进组织修复再生、抗微生物的作用。坏死性凋亡由刺激因素级联激活RIPK1、RIPK3、MLKL导致细胞出现受调控的死亡。坏死性凋亡诱发因素与凋亡类似,是细胞凋亡受阻时的备选死亡方式,形态学上与坏死表现相似,体现为细胞器肿胀、质膜破裂。越来越多的研究表明,坏死性凋亡在ALI/ARDS的进程中起着重要作用。而且最新的研究显示高渗应激、高血糖均可导致细胞出现坏死性凋亡。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)转录因子家族由五个亚型组成(NFAT1–NFAT5),调节T细胞的激活和分化,而且还调节细胞周期、死亡等的重要基因。通过生物信息学分析发现NFATc2为受体相互作用丝氨酸苏氨酸激酶1(receptor interacting serine threonine kinase 1,RIPK1)上游的转录因子,NFATc2可致使RIPK1的表达上调。由此我们推测,UMSC-Exo是否能通过影响NFATc2的表达从而减轻海水诱导的肺损伤呢?二、研究目的(一)优化海水诱导肺损伤的细胞模型条件,分离纯化脐带间充质干细胞来源的外泌体(UMSC derived exosome,UMSC-Exo),并在细胞模型中验证UMSCExo是否能减轻海水诱导肺损伤;(二)探讨UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤细胞模型可能的机制;(三)在体实验验证UMSC-Exo是否能减轻海水诱导小鼠肺损伤。三、研究方法(一)优化海水诱导肺损伤的细胞模型、鉴定所提取外泌体、研究UMSCExo对海水诱导肺损伤的作用首先通过CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂检测不同海水量和刺激时间对细胞活力的影响,确定海水诱导肺损伤细胞模型的构建条件。收集使用无外泌体血清培养的UMSC上清液,采用标准的差速离心法分离、纯化外泌体。采用Western Blot检测外泌体表达的标志蛋白、透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析外泌体粒径。使用含海水的培养基诱导后,更换新的正常培养基并加入UMSCExo,采用PKH-67染色检测UMSC-Exo能否被BEAS-2B细胞所摄取。通过CCK8检测细胞活力、JC-1试剂盒对线粒体膜电位染色、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞膜完整性、Annexin V试剂盒检测细胞死亡情况,研究UMSC-Exo对海水诱导细胞损伤的作用。(二)UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤细胞模型的机制研究首先,筛选海水诱导BEAS-2B细胞损伤中主要细胞死亡方式和关键调控基因。基于海水诱导肺损伤的细胞模型以及最佳治疗浓度UMSC-Exo减轻海水诱导肺损伤进行转录组测序。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)查找海水诱导后富集的细胞死亡方式而在UMSC-Exo治疗后受到抑制的细胞死亡方式为坏死性凋亡;通过WB检测海水诱导肺损伤中坏死性凋亡执行蛋白pMLKL、MLKL、p-RIPK3、RIPK1、RIPK3的及凋亡标志性蛋白Caspase-8的表达水平进一步验证。查找海水诱导后表达上调而UMSC-Exo治疗后表达下调的差异基因,通过生物信息学分析,发现可以靶向调控坏死性凋亡的转录因子,两者对比确定影响坏死性凋亡的关键基因NFATc2。通过WB和qPCR验证NFATc2在USMC-Exo减轻海水诱导BEAS-2B细胞损伤中的变化情况。通过荧光素酶试验的方法验证转录因子NFATc2对RIPK1的靶向调控作用。si-NFATc2转染BEAS-2B后,通过CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞及WB验证NFATc2在海水诱导坏死性凋亡中的作用。其次,筛选UMSC-Exo中能够靶向NFATc2的miRNA。从GEO数据库中查找脐带间充质干细胞外泌体的miRNA测序数据集,选取表达量排名前100的miRNA取交集;从数据库中(Target Scan、miRDB、miRWalk、mir DIP、miRTar Base)筛选能够调控NFATc2的miRNA,并与UMSC-Exo表达的miRNA进行比对,筛选出可以靶向调控NFATc2的候选miRNA,并与正常BEAS-2B细胞中候选miRNA表达量对比。设计构建候选miRNA的模拟物,通过WB和qPCR的方法验证可以靶向NFATc2的miRNA模拟物,进一步通过双荧光素酶的试验方法进行验证miRNA对NFATc2的靶向调控作用。使用CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞和WB验证目的miRNA模拟物在海水诱导细胞损伤中对NFATc2表达的影响及对坏死性凋亡的影响。(三)UMSC-Exo抑制坏死性凋亡减轻海水诱导小鼠急性肺损伤的验证研究采用经口气管插管缓慢注入海水的方法建立小鼠SW-ALI模型,治疗组注入海水6小时后给予USMC-Exo治疗。使用HE染色观察小鼠肺组织病理变化,通过量化肺组织AZD2281化学结构损伤评分评估肺损伤的严重程度。通过腹主动脉采血进行血气分析评估气体交换障碍情况。通过小鼠肺组织称湿/干质量比评估肺水肿情况。使用胸部X线评估双肺渗出情况。检测肺泡灌洗液炎症因子评估炎症情况。对小鼠肺组织切片目的基因即坏死性凋亡相关进行免疫组织化学分析、免疫荧光染色。最后用Western Blot检测NFATc2和坏死性凋亡相关蛋白,验证在体实验结果是否同细胞实验结果一致。四、研究结果(一)制定海水诱导肺损伤细胞模型的条件、提取外泌体符合标准、UMSCExo减轻海水诱导细胞BEAS-2B损伤海水含量为20%的培养基刺激6h可以诱导BEAS-2B细胞活力下降达50%,并以此作为海水诱导肺损伤细胞模型的条件。Western Blot结果显示UMSC-Exo表达CD9、CD63、Alix,但不表达Calnexin。透射电镜下显示外泌体具有单层膜结构、一侧凹陷的半球形。粒径分析显示提取的UMSC-Exo直径集中在60-120nm之间。示踪实验表明UMSC-Exo能够被BEAS-2B细胞所摄取。相较于海水诱导组,加入UMSC-Exo治疗后细胞活力恢复,JC-1染色显示绿色荧光减弱、红色荧光增强,PI染色红色荧光减弱,死亡细胞数量减少。UMSC-Exo的治疗效果随着剂量的增加而增强,其最佳治疗浓度为50μg/ml。(二)UMSC-Exo来源的miR143-3p通过靶向调控NFATc2减轻海水诱导细胞坏死性凋亡实验一:NFATc2是调控海水诱导坏死性凋亡中的关键基因1、UMSC-Exo通过抑制坏死性凋亡减轻海水诱导的细胞损伤GSEA显示BEAS-2B受到海水刺激时出现的细胞死亡方式而在UMSC-Exo治疗后受到抑制的细胞死亡方式为坏死性凋亡显著(P<0.05)。WB结果显示,海水诱导后坏死性凋亡执行蛋白p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达增加,RIPK3表达有所降低,抑制坏死性凋亡的Caspase-8表达下降,MLKL表达变化不明显。而加入UMSC-Exo后p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达下降,RIPK3表达增加,Caspase-8表达增加,MLKL表达变化不明显。2、转录组测序筛选海水诱导BEAS-2B细胞损伤中的差异表达基因海水诱导后表达上调,在UMSC-Exo治疗后表达下调的基因有26个,其中包括4个转录因子:NFATc2、LTF、MAFF、NR4A3。热图显示差异显著性排名前50基因中所含的转录因子:NFATc2、LTF、MAFF。火山图中差异显著性最大的基因为:NFATc2。3、生信分析可能靶向坏死性凋亡的转录因子及验证PROMO数据库找RIPK1的预测转录因子,与转录测序筛选的有差异的四个转录因子进行对比,预测转录因子NFATc2可能是调控坏死性凋亡的关键基因。JASPAR网站中查找NFATc2能够在RIPK1启动子的结合位点序列并设计结合位点突变序列。荧光素酶实验结果显示,NFATc2质粒能够与野生型RIPK1启动子序列结合、荧光增强。4、NFATc2在UMSC-Exo治疗海水诱导肺损伤细胞模型中的表达验证WB和qPCR检测发现海水诱导后NFATc2的m RNA和蛋白表达水平均增加,UMSC-Exo治疗后NFATc2的m RNA和蛋白表达水平均将低。5、NFATc2在si RNA转染的BEAS-2B细胞中与坏死性凋亡关系通过CCK8、JC-1染色、PI染色、流式细胞及WB验证NFATc2在海水诱导坏死性凋亡中的作用。(1)si-NFATc2转染的细胞NFATc2的m RNA和蛋白表达水平下降;(2)si-NFATc2转染后的细胞减少海水诱导的细胞活力下降;(3)si-NFATc2转染后的细胞降低海水诱导的线粒体膜电位下降;(4)si-NFATc2转染后的细胞降低海水诱导的细胞膜破坏;(5)si-NFATc2转染后的细胞减少海水诱导的细胞死亡;(6)si-NFATc2转染后的细胞海水诱导后p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达下降,RIPK3表达增加,Caspase-8表达增加。上述结果提示si-NFATc2转染细胞后NFATc2表达下调,坏死性凋亡相关蛋白的表达受到负性调节,抑制了坏死性凋亡的发生。实验二:UMSC-Exo通过miR143-3p靶向调控NFATc21、UMSC-Exo中靶向调控NFATc2的miRNA筛选结果GSE159814和GSE69909数据集中表达量排前100的miRNA共有51个;Target Scan、miRDB、miRWalk、mir DIP、miRTar Base数据库预测可能结合到NFATc2基因3’UTR的miRNA共6个,两者再次取交集获得候选miRNA共4个:miR-7-5p、miR-143-3p、miR-221-3p、miR-222-3p。4个候选miRNA在正常BEAS-2B中的表达量均在较低水平。2、UMSC-Exo中靶向调控NFATc2的候选miRNA的验证4个候选miRNA模拟物转染细胞后,miR-143-3p的模拟物使NFATc2的m RNA和蛋白水平表达下降。查找miR-143-3p在NFATc2基因m RNA上3’UTR的结合位点序列,设计构建野生型、突变型结合位点载体,荧光素酶实验表明,miR-143-3p模拟物使野生型3’UTR荧光强度明显减弱,说明miR-143-3p能够与NFATc2的3’UTR靶向结合。3、miR-143-3p对海水诱导BEAS-2B细胞坏死性凋亡的影响(1)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转然后可以减轻海水诱导的细胞活力下降;(2)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以使海水诱导的细胞线粒体膜电位增加;(3)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以减少海水诱导细胞膜质膜破坏;(4)与UMSC-Exo效果相似,miR-143-3p模拟物转染后可以减少海水诱导细胞死亡;(5)与UMSC-Exo效果相似,海水诱导细胞坏死性凋亡增加,miR-143-3p模Pexidartinib纯度拟物转染后可以抑制海水诱导细胞死亡。(三)UMSC-Exo抑制坏死性凋亡减轻海水诱导小鼠急性肺损伤中的在体验证研究1、小鼠动脉血气的变化海水诱导小鼠肺损伤可导致pH、pO2、SaO2出现明显的下降,pCO2、乳酸HCO3-升高。UMSC-Exo治疗后,pH、pO2、SaO2有所上升,pCO2、乳酸HCO3-下降。2、小鼠胸部X线改变海水诱导后小鼠胸部X线出现双肺弥漫性渗出,经UMSC-Exo治疗后小鼠双肺渗出有所减少。3、小鼠肺脏病理改变及肺组织损伤评分海水诱导后小鼠肺组织出现明显的中性粒细胞浸润、肺泡间隔增厚、肺泡塌陷、肺泡腔和间质出血增加;UMSC-Exo治疗后,中性粒细胞浸润减少、肺泡间隔厚度减少,肺泡腔和间质出血。海水诱导后小鼠肺组织的肺损伤评分增加,UMSC-Exo治疗后肺损伤评分降低。4、小鼠肺组织湿/干质量比海水诱导后小鼠肺组织湿/干质量比增加,UMSC-Exo治疗后,湿/干质量比降低。5、小鼠肺泡灌洗液炎症因子检测海水诱导后小鼠肺泡灌parenteral antibiotics洗液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α明显增高,给予UMSC-Exo治疗后可明显下降。6、肺组织NFATc2、p-MLKL、RIPK1免疫组织化学海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、RIPK1的表达增加。UMSC-Exo治疗后NFATc2、p-MLKL、RIPK1的表达下降。7、肺组织NFATc2、p-MLKL、RIPK1免疫荧光海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、RIPK1的荧光增强、表达增多。UMSC-Exo治疗后NFATc2、p-MLKL、RIPK1的荧光减弱、表达减少。8、肺组织NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、MLKL、RIPK3、RIPK1、Caspase-8的蛋白印迹检测海水诱导小鼠肺组织中NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1的表达增加,RIPK3、Caspase-8是下降的。外泌体治疗后NFATc2、p-MLKL、p-RIPK3、RIPK1表达有所降低,RIPK3、Caspase-8有所升高。五、研究结论(一)UMSC-Exo可以减轻海水诱导BEAS-2B细胞损伤;(二)UMSC-Exo通过miR-143-3p靶向调控NFATc2抑制坏死性凋亡减轻海水BEAS-2B细胞损伤;(三)在体实验中UMSC-Exo减轻海水诱导小鼠急性肺损伤,NFATc2及坏死性凋亡相关蛋白表达与离体细胞实验结果一致。

目的 探究生长分化因子15(GDF15)对自身免疫性肝炎(AIH)诊断和疗效的临床意义。方法 纳入2020年7月至2022年7月收治的65例Oncolytic vaccinia virusAIH患者，45例健康体检者，乙型肝炎和丙型肝炎患者各40例，35例原发性胆管炎(PBC)患者。比较各组研究对象的临床资料、肝硬化和非肝硬化患者血清GDF15水平。多因素回归分析发生肝硬化的影响因素，ROC曲线下面积评估GDF15的诊断价值。结果 AIH患者ALT、AST、Fib4指数、IgG以及TBil分别为(368.9±59.8)U/L、(294.6±52.7)U/L、(5.8±2.5)、(2668.3±901.5)mg/dL、(49.6±11.5)μmol/L,健康对照组分别为(24.5±4.8)U/L、(8.4±2.1)U/L、(1.1±0.3)、(476.2±172.8)mg/dL、(3.4±1.3)μmol/L,乙型肝炎组分别为(61.7±25.8)U/L、(50.9±18.5)U/L、(3.2±1.5)、(953.6±253.4)mg/dL、(18.8±5.2)μmol/L,丙型肝炎组分别为(48.4±12.5)U/L、(48.6±21.4)U/L、(4.1±1.6)、(1868.6±539.8)mg/dL、(19.2±5.3)μmol/L,PBC组分别为(59.6±11.2)U/L、(42.3±20.1)U/L、(1.5±0.8)、(641.5±125.8)mg/dL及(12.3±3.7)μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。而AIH患者GDF15为(2000.9±699.2)pg/dL,高于对照组(476.2±172.8)pg/dL、乙型肝炎组(953.6±253.4)pg/dL和PBC组(641.5±125.8)pg/dL(P<0.05)。肝硬化AIH患者血清ALT、AST、Fi购买LY-188011b4指数以及GDF15水平分别为(461.7±55.8)U/L、(298.4±41.1)U/L、(6.1±2.3)及(2045.1±350.8)pg/dL,高于非肝硬化AIH患者的(224.5±24.8)U/L、(RSL380.9±18.5)U/L、(3.8±1.5)及(1305.2±200.2)pg/dL(P<0.05)。GDF15是AIH患者肝硬化发生的独立危险因素(P<0.05)。以GDF15=1639.0 pg/dL为临界点，GDF15诊断AIH肝硬化的AUC、敏感度及特异度分别为0.924、93.3%(14/15)和82.5%(33/40)。结论 AIH患者的GDF15水平较高，对评估AIH患者是否发生肝硬化具有一定应用价值。

肉兔具有低投资、高育肥效率、繁殖周期短等特点,同时兔肉营养价值高,含有约20%的蛋白质。肉兔在断奶时由于消化系统及免疫系统未发育完善,容易受病原微生物侵袭导致菌群失衡,引起腹泻等疾病,造成发育受阻、甚至死亡。燕麦β-葡聚糖是一种天然多糖,具有抗炎、抗氧化、增强免疫及调节肠道稳态等多种生物学功能,这与断奶仔兔免疫缺失、消化系统发育不完善的生理特点相适应。因此,本研究通过整合多组学技术探究燕麦β-葡聚糖对断奶仔兔生长性能、肠道菌群和血清代谢物的影响,旨在为燕麦β-葡聚糖在肉兔养殖中的应用提供理论依据。试验一燕麦β-葡聚糖对断奶家兔生长性能、部分血清指标及盲肠形态的影响试验选取3周龄断奶新西兰白兔24只,随机分为对照组(CT组,n=12)和试验组(BG组,n=12),试验预试期7 d,正试期28 d,试验期间两组家兔统一饲喂基础饲粮,正试期开始后每天在BG组家兔饮水中添加200 mg/kg BW燕麦β-葡聚糖,连续添加28 d。试验期间每周统计体重和采食量,计算平均日增重、平均日采食量及料重比,记录各组腹泻只数与死亡只数,计算腹泻率与死亡率。在正试期第28 d采集免疫器官(脾脏、圆小囊和胸腺)并称取湿重,计算免疫器官指数;采集血清,ELISA法检测血清中IElexacaftorL-1β、TNF-α、LPS和二胺氧化酶(DAO)水平;采集盲肠组织,进行H&E和PAS染色,测定盲肠绒毛高度、隐窝深度、肌层厚度、杯状细胞数量并计算绒毛高度和隐窝深度的比值(绒隐比)。结果显示:(1)BG组家兔体重呈上升趋势,在第14 d和第21 d显著增加(P<0.05),在第28 d极显著增加(P<0.01)。燕麦β-葡聚糖显著增加平均日增重和平均日采食量(P<0.05),但未改变料重比(P>0.05)。两组脾脏指数、胸腺指数和圆小囊指数均无显著差异(P>0.05)。(2)BG组血清LPS、IL-1β和TNF-α浓度极显著降低(P<0.01),两组血清DAO水平无显著差异(P>0.05)。(3)BG组家兔绒毛高度、肌层厚度和杯状细胞数量高于CT组,但差异不显著(P>0.05),BG组绒隐比有升高的趋势,但差异不显著(P=0.07)。试验二燕麦β-葡聚糖对断奶家兔盲肠菌群的影响在正试期结束后采集各组家兔盲肠内容物进行16S r RNA测序,分析饲喂燕麦β-葡聚糖后家兔盲肠菌群结构、多样性及组成的变化。多样性分析表明燕麦β-葡聚糖干预下两组家兔盲肠菌群多样性无显著差异(P>0.05)。物种组成分析发现,在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是家兔盲肠中最丰富的菌门,占比均>95%;在属水平上,RBioactive wound dressingsuminococcaceae NK4A214 group和Christensenellaceae R-7 group相对丰度最高。对相对丰度>0.1%的菌门和菌属进行差异性检验,以P<0.1为标准筛选差异菌群,以P<0.05为标准筛选显著差异菌群,结果发现在门水平上BG组中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著低于CT组(P<0.05);在属水平上共筛选到5种差异菌属,其中BG组中Shuttleworthia、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)相对丰度显著高于CT组(P<0.05),Odoribacter、Enterorhabdus和Ruminiclostridium 1相对丰度较CT组有升高趋势(0.05≤P<0.1)。试验三燕麦β-葡聚糖对断奶家兔血清代谢物的影响在正试期结束后采集各组家兔血清,采用非靶向代谢组学技术检测各组家兔血清中的代谢谱,结合多元和单变量统计方法,以VIP>1,P<0.1为标准筛选差异代谢物,以VIP>1,P<0.05为标准筛选显著差异代谢物,并进行相关生物信息学分析。结果发现,BG组和CT组共鉴定到42种差异代谢物(VIP>1,P<0.1),其中26种为显著差异代谢物(VIP>1,P<0.05),主要由脂质(鞘脂类、甘油磷脂类等)、糖类(丙酮酸、苹果酸、顺乌头酸等)和氨基酸及其衍生物(L-苯丙氨酸、犬尿氨酸、肌肽等)组成,这些差异代谢物参与调节糖代谢、氨基酸代谢及脂质代谢等多条代谢通路,其中三羧酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、初级胆汁酸生物合成、组氨酸代谢、鞘脂代谢、丙酮酸代谢、苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸生物合成和亚油酸代谢通路显著改变(P<0.05),苯丙氨酸代谢也发生改变(0.05≤P<0.1)。试验四临床指标、盲肠微生物组与血清代谢组关联性研究(1)通过对5种表型指标与5种差异菌属进行Spearman相关性分析发现,差异菌属与炎症相关指标LPS、TNF-α和IL-1β呈负相关(r<0),与生长性能相关指标ADG和ADFI呈正相关(r>0)。(2)使用Spearman相关性分析方法对筛选到的42种血清差异代谢物和5种差异菌属进行相关性分析,结果发现差异菌属与29种血清差异代谢物呈显著相关(|r|>0.4,P<0.05),参与糖代谢及氨基酸代谢的血清差异selleckchem GSK1349572代谢物与差异菌群呈正相关(r>0),而脂代谢相关血清差异代谢物与差异菌群呈负相关(r<0)。(3)使用Spearman相关性分析方法对筛选到的42种血清差异代谢物和5种表型指标进行相关性分析,发现TNF-α、IL-1β和LPS与31种血清差异代谢物显著相关(|r|>0.4,P<0.05),而ADG、ADFI只与10种血清差异代谢物显著相关(|r|>0.4,P<0.05)。(4)进一步使用Spearman相关性分析方法对炎症相关指标和生长性能相关指标进行相关性分析发现,炎症相关指标与生长性能相关指标呈负相关(r<0),其中,ADFI与TNF-α显著负相关(r<-0.4,P<0.05)。结论:饮水中添加200 mg/kg BW燕麦β-葡聚糖28 d后:(1)增加断奶家兔提高平均日增重和平均日采食量,抑制机体系统性炎症水平,增强肠道功能;(2)盲肠内容物16S r RNA测序结果表明菌群多样性不变,物种组成发生改变;(3)血清代谢谱发生改变,血清糖代谢、氨基酸代谢水平增加,脂代谢水平减弱;(4)关联分析结果表明燕麦β-葡聚糖可能通过调控肠道菌群,影响机体代谢,抑制机体系统性炎症水平,进而促进动物生长。

向日葵是原产于北美洲的菊科向日葵属的双子叶植物,具有极高的食用价值、药用价值、观赏价值。类黄酮代谢途径长期以来一直被认为控制着花、水果和蔬菜的颜色产生,近年来其机理已在多种植物中被阐明,而向日葵花色相关的类黄酮代谢却鲜有研究,因此明确向日葵花色调控机理对向日葵育种具有重要意义NN2211分子式。本研究通过对三个向日葵品种进行了类黄酮及花青素提取和转录组分析挖掘了向日葵花色相关结构基因和转录因子,在烟草上进行相关转录因子的农杆菌瞬时表达明确了转录因子的互作机制,还创立了一种新的侵染方式,以TVR病毒为载体的VIGS侵染技术为基础,利用烟草实现病毒扩繁,再侵染向日葵植株实现相关基因的转录后沉默,对转录因子的功能进行了反向遗传学验证,进一步证实了本实验挖掘出的转录因子具有激活花青素途径的功能。主要研究结果如下:1.对Yr17、Yr35和Pc103三个品种的向日葵进行花青素和黄酮醇的提取及含量测定,对比三个样品的产物成分。和表型相符,只有红花Pc103样品中检测到花青素,而在两个黄色样品中几乎检测不到花青素;用紫外分光光度计测定样品的总黄酮和黄酮醇含量,发现黄酮醇和花青素的含量呈负相关关系。2.构建了Pc103、Yr17和Yr35三个品种的向日葵的RNA-Seq文库,比较了黄色向日葵和红色向日葵的基因表达差异,发现了多个差异表达基因,用GO分析将其进行分类。还筛选出了与黄酮类化合物合成相关的基因,推测结构基因的差异性表达控制了类黄酮途径中代谢产物的流向,影响了最终产物的合成,决定了黄酮醇或花青素的积累。筛选出alkaline media了两个差异性表达的转录因子,并对其进行核苷酸序列分析,发现基因的序列变异导致了它们表达水平或调控功能的不同,进而影响了下游产物的积累,最终导致了红色和黄色的不GW-572016体内实验剂量同向日葵表型。3.在烟草中对筛选出的差异性表达的转录因子按照不同的组合进行瞬时表达实验,发现两个转录因子共同作用能激活向日葵的花青素途径,证实了两个转录因子间的互作作用。4.观察并记录花器官发育过程,从向日葵出现花蕾到花瓣完全绽放期间每天对其进行拍照记录,进而确定了在向日葵上进行VIGS实验的侵染时间,使花瓣发育时间处于VIGS系统作用时间内。5.构建以TRV为载体向日葵侵染体系,在向日葵花器官上对两个转录因子进行沉默,成功抑制了花青素途径,对两个转录因子进行了反向遗传学验证,证实了两个转录因子的功能。

探讨重楼总皂苷诱导乳腺癌MCF-7细胞的铁死亡作用及机制，为重楼总皂苷临床治疗乳腺癌提供理论依据。通过噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）实验检测不同浓度重楼总皂苷对MCF-7细胞增殖能力的影响；倒置显微镜观察MCF-7细胞形态改变；平板克隆实验检测MCF-7细胞克隆形成能力；乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase， LDH）释放实验检测MCF-7细胞膜的完整性；划痕实验检测MCF-7细胞迁移能力；利用荧光倒置显微镜检测MCF-7细胞中活性氧（reactive oxygen speciqatar biobankes，ROS）的水平，利用试剂盒检测MCF-7细胞中亚铁离子的含量；透射电镜观察MCF-7细胞线粒体超微结构；采用Western blot检测重楼总皂苷对MCF-7细胞中p53、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family BMN 673试剂member 4， ACSL4）、转铁蛋白受体1（transferrin receptor protein 1， TFR1）表达的影响。结果显示，1.5、3、4.5、6、7.5、9 μg·mL~(-1)重楼总皂苷均能显著抑制MCF-7细胞增殖，IC_(50)为4.12 μg·mL~(-1)，对细胞形态有明显的损伤，导致细胞形成空泡，逐渐皱缩并脱落；抑制MCF-7细胞的克隆形成能力，破坏细胞膜促使细胞内LDH释放此网站，缩短MCF-7细胞的迁移距离抑制迁移能力；显著提高MCF-7细胞中ROS的含量，诱导细胞氧化损伤，导致细胞内亚铁离子堆积，线粒体结构也发生明显的改变，线粒体膜密度增加，嵴减少甚至消失；促进p53蛋白表达，下调SLC7A11和GPX4表达并增强ACSL4和TFR1表达。因此，重楼总皂苷可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移能力、破坏细胞结构，其机制可能与诱导细胞铁死亡有关。

利用不同浓度铁死亡诱导剂RSL3作用于人胰腺癌细胞PANC-1，以探究RSL3对胰腺癌中癌基因TRIM2表达的影响．利用MTT，光学显微镜拍照，qRT-PCT以及Western Blot等检测手段，分析细胞的存活率以及TRIM2基因表达的变化．随着RSL3浓度的增加，PANC-1细胞的存活率降低，呈现剂量依赖性，RSL3的半致死浓度为4.73μmol·L-1；与对照组细胞相比较，细胞中加入半致死浓度的RSL3后，细胞存活率降低了50%，光学显微镜下细胞形态基本丧失；而与对照组相比，在细胞中同时加入RSL3和Fer-1后，对细胞的存活率基本没有影响，光学显微镜下细胞边界清楚．与对照组细胞相比，RSL3作用24 h后的细胞中，TRIM2基因的表达在mRNA水平以及蛋白质水平都被抑制，但是与对照组Naporafenib相比较，细selleck抑制剂胞中同时加入RSL3和Fer-1后，TRIM2基因的表达被恢复．铁死亡诱导剂RSAnthocyanin biosynthesis genesL3可以抑制癌基因TRIM2的表达．

第一部分用于预测肾嫌色细胞癌患者预后和肿瘤微环境的铁死亡相关预后模型的构建和验证目的:铁死亡是一种区别于细胞坏死、凋亡、自噬的新型细胞死亡形式,它在抑制肿瘤生长方面具有重要作用。然而,铁死亡相关基因在肾嫌色细胞癌中的作用还不清楚。本研究的目的是构建和验证肾嫌色细胞癌基于铁死亡相关基因的预后模型,并探讨其在免疫细胞浸润和系统治疗中的作用。方法:从TCGA数据库中获得肾嫌色细胞癌患者的基因表达谱和临床数据,通过单变量Cox回归分析来筛选预后相关的铁死亡相关基因,通过共识聚类分析得到基于铁死亡相关基因的分子亚型。通过LIMMA程序包获得肿瘤组织和癌旁正常肾组织差异表达的基因,Lasso回归被用来在训练集中建立基于铁死亡相关基因的预后模型,风险分数由铁死亡相关基因表达量和相应系数计算得出,根据铁死亡风险评分的中位值将肾嫌色细胞癌患者分为低风险组和高风险组,采用Kaplan-Meier曲线对比高低风险组间总生存期差异,并在测试集中进行验证,单因素和多因素cox回归用于确定风险评分和肾嫌色细胞癌患者总生存期之间的关系和肾嫌色细胞癌的独立预后因子,列线图被用来预测患者的5年总生存率。通过ss GSEA算法和ESTIMATE算法探讨基于铁死亡相关基因的分子亚型和预后模型与免疫微环境之间的关联,并计算高低风险组肿瘤突变负荷,以预测对免疫治疗的反应。铁死亡风险评分和患者对靶向药的敏感性之间的关联通过GDSC数据库和Cell Miner数据库评估Myoglobin immunohistochemistry。在青岛大学附属医院就诊的60名肾嫌色细胞癌患者被纳入研究进行外部验证。免疫组化实验被用来验证铁死亡相关基因在肿瘤和癌旁组织中的表达差异,以及验证基因表达与肿瘤分期和预后的关系。结果:从TCGA数据库下载并分析了66例肾嫌色细胞癌样本,划分为两个基于铁死亡相关基因的分子亚型(1型和2型),2型比1型总体生存期更差,1型的免疫细胞浸润水平、MHC及免疫检查点基因的表达水平高于2型。18个铁死亡相关基因在肿瘤和正常组织中差异表达,经Lasso回归分析,铁死亡相关基因TFRC和SLC7A11被确定用于构建预后模型。基于铁死亡风险评分的高风险组总体生存期比低风险组更差,并在测试集中得到了验证。铁死亡风险评分是总体生存期的独立预后因子,ROC曲线下面积为0.846,表明该模型具有良好的预测能力,校准曲线显示预测值和实际值基本一致,表明列线图有很好的一致性。对免疫细胞和免疫相关通路进行评分,发现相比高风险组,低风险组有更高的免疫细胞浸润水平,以及更高的MHC和免疫检查点基因的表达水平,说明低风险组对免疫治疗反应更好。我们的研究显示吉非替尼、维利帕尼、维莫德吉、PD184352和SL 0101-1药物在高风险组的患者中的敏感性更高。免疫组化实验分析显示,与癌旁正常肾组织相比,TFRC和SLC7A11在肾嫌色细胞癌肿瘤组织中表达水平更高,更高的表达水平与更高的肿瘤分期和更差的肿瘤特异性生存期显著相关。结论:我们构建并验此网站证了预测肾嫌色细胞癌预后的基于铁死亡相关基因的预后模型,该模型与免疫细胞浸润、免疫检查点表达和靶向药物反应之间存在明显关联,有助于判断肾嫌色细胞癌患者的预后和指导治疗,协助制定临床决策。第二部 分肾嫌色细胞癌中四分类病理分级系统的外部验证目的:由于肾嫌色细胞癌固有的核不典型性,用Fuhrman分级系统对肾嫌色细胞癌进行分级是不适合的。本研究目的是外部验证Avulova等人最近提出的四分类病理分级系统的预后价值,并探索另一个将肿瘤凝固性坏死作为单独的病理分级3级的四分类分级系统的预后预测能力。方法:我们收集了2008年至2020年在青岛大学附属医院接受手术治疗的未发生转移的263名肾嫌色细胞癌患者的临床数据,病理信息由病理医生进行重新阅片,并划分病理分级。使用Kaplan-Meier方法计算四分类病理分级的生存率,通过Cox比例风险回归模型计算危险比(HRs)和95%置信区间(CIs)来评估四分类分级系统与肿瘤特异性生存期(CSS)和无远处转移生存期(DMFS)的关联。结果:263名肾嫌色细胞癌患者中,10名患者死于肾嫌色细胞癌,12名患者出现转移,5年肿瘤特异性生存率为95.9%。在单变量分析中,四分类分级系统中的2级(HR=11.6;95%Cl:1.20-111.3;P=0.03)、3级(HR=24.9;95%Cl:2.59-239.8;P=0.005)和4级(HR=302.9;95%Cl:34.6-3250.8;P<0.001)与较差的肿瘤特异性生存显著相关,并且在被其他变量调整后结果仍然显著。然而,2级和3级之间的肿瘤特异性生存差异并不显著(HR=2.14,95%CI 0.43-10.63;P=0.35)。伴有凝固性坏死作为单独3级的探索性分级系统与肿瘤特异性生存之间的关联如下:2级,HR=10.2,95%Cl:1.06-97,P=0.04;3级,HR=11.4,95%CSAGl:1.18-109,P=0.04;4级,HR=267.9,95%Cl:27.6-2603,P<0.001,同样,2级和3级之间没有显著差异。结论:四分类分级系统中的3级相比2级没有显著增加死亡和转移的风险,Paner等人提出的三分类分级系统比Avulova等人提出的四分类分级系统更适合预测肾嫌色细胞癌的预后。

目的：观察参芪补髓汤联合化疗加免疫疗法治疗气血两虚型晚期CCRG 81045抑制剂无驱动基因突变非小细胞肺癌的临床疗效。方法：将90例气血两虚型晚期无驱动基因突变非小细胞肺癌患者随机分为治疗组和对照组，每组各45例。对照组患者采用化疗(吉西他滨+顺铂)加信迪利单抗治疗，治疗组在对照组基础上加用参芪补髓汤治疗。治疗结束后，观察2组中医证候疗效、Karnofsky量表(KPS)评分及骨髓抑制分度(白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、血小板下降分度)情况。结果：中医证候疗效总有效率治疗组为84.44%(38/45),对照组为57.78%(26/45),2组比较，差异有统计学意义(P<0.05);KPS评分治疗前后组内比较及治疗后组间比较，差异均有统计学意义(Medical order entry systemsP<0.01);治疗后治疗组白细胞、中性粒细胞、血红蛋白、血小板下降分度情况均优于对照组(P<0.05)。结论：参芪补髓汤联合化疗加免疫疗法治疗晚期无驱动基因突selleck变非小细胞肺癌，能改善患者中医证候，提高生活质量，减轻骨髓抑制程度。

目的：利用网络药理学和分子对接技术探讨黄精治疗糖尿病的潜在活性成分及作用机制。方法：通过TCMSP中草药系统药理学平台和DisGeNET数据库、NCB数据库、TTD数据库分别获取药物的化学成分、作用靶点及疾病的相关靶点；利用Cytoscape 3.8.0软件对数据进行药物-活性成分-作用靶点的网络关系图的构建；使用S点击此处tring数据库构建PPI网络模型；运用Metascape平台进行GO和KEGG功能分析；通过Pubchem数据库、PDB数据库Integrated Microbiology & Virology、Chem Bio3D Ultra 14.0软件、PyMOL 2.4.0软件和Auto Dock Tools 1.5.6软件对进行分子对接。结果：共筛选出黄精活性成分8个，成分作用靶点75个，黄精SARS-CoV抑制剂与糖尿病共有靶点共29个；主要活性成分为DFV、β-谷甾醇、薯蓣皂苷元和黄芩素等，从PPI网络中得到核心靶点为AKT1、TP53、HIF1A等；KEGG富集有癌症、肝炎、lipid and atherosclerosis等多条信号通路；分子对接结果显示，关键活性成分与核心靶点均能自由结合，β-谷甾醇与AKT1有较强的相互作用。结论：黄精治疗糖尿病具有多成分、多靶点、多通路的特点，其作用机制可能与癌症、肝炎、lipid and atherosclerosis等多条信号通路有关。