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研究背景及目的骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性极大的恶性髓系血液疾病,主要表现为髓系造血干祖细胞一系或多系发育异常导致骨髓无效造血、外周血细胞单系或多系减少、高风险向急性髓系白血病转化。不同疾病亚型、不同危险分层患者的临床结局差别可以很大。因此,准确预测对MDS患者预后,对指导患者个体化治疗有着十分重要的临床意义。遗传缺陷在MDS分子发病机制中起着重要作用,结合多种遗传缺陷信息能够完善MDS患者的预后评估。WT1基因是一种“泛白血病”基因,编码一种转录因子调节细胞生长及分化的过程,其表达水平在正常造血过程中呈动态变化。在包括MDS在内的许多血液系统肿瘤中,WT1呈现持续高表达状态,往往提示预后差。然而,WT1基因表达水平与MDS不同亚型、白血病转化是否相关,合screening biomarkers并其他与预后相关的分子异常是否会影响WT1表达水平及其预测预后的能力,目前尚无定论。因此,本研究回顾性分析了WT1基因表达水平与MDS亚型、疾病进展、治疗方式、生存预后的关系,并结合细胞遗传学异常、基因突变进一步探索WT1基因表达水平在不同遗传背景中的临床意义。研究方法1、第一章回顾性分析在南方医科大学南方医院就诊的225例初发MDS患者的临床资料,应用实时荧光定量PCR检测骨髓WT1基因表达,探讨WT1基因表达水平与MDS亚型、IPSS-R评分关系,再根据其表达水平分为WT1+和WT1-两组,比较两组患者的临床特点、疾病进展速度、治疗方式、生存预后的差异。2、第二章一共纳入215例初发MDS患者,所有患者一经确诊均同时采用实时荧光定量PCR检测WT1基因表达水平、二代测序检测基因突变以及染色体显带技术检测染色体核型。该章回顾性分析了WT1基因表达水平与细胞遗传学异常、基因突变的关系,并进一步探索WT1基因表达水平在不同遗传背景中的临LGK-974说明书床意义。结果1、在第一章,我们发现WT1基因在MDS患者中有较高的阳性率,其表达水平随着MDS亚型恶性程度增加、IPSS-R危险分层增高呈现上升趋势,与骨髓原始细胞比例、IPSS-R评分呈正相关,可作为临床上评估MDS病情及对MDS患者危险度精准分层的重要指标。此外,WT1基因表达水平可用于MDS与其他非MDS相关的血细胞减少疾病的鉴别诊断。MDS患者的总生存期、白血病转化均受WT1表达水平的影响,WT1+患者中位生存时间短、疾病进展快、白血病转化风险高。WT1+移植患c-Met抑制剂者预后明显优于减细胞治疗、免疫治疗及支持治疗患者,且死亡率较低。2、第二章,我们发现WT1基因表达受其他基因突变的影响。TP53、SRSF2、U2AF1、TET2或CD101突变的MDS患者WT1表达水平降低,而NPM1突变患者WT1表达水平上升。WT1过度表达在不同遗传背景下具有不同的意义,其高水平表达仅在无TP53基因突变的MDS患者中提示预后差。结论WT1基因表达水平可用于评估MDS患者病情,与患者预后密切相关,移植可以改善高表达患者预后。WT1表达水平还受其他基因突变的影响,整合基因突变信息可以提高WT1基因表达水平对MDS患者预后进行准确预测的能力。

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,简称T2DM)是一种复杂的以血糖升高、血脂异常为特征的内分泌代谢疾病,包括不同程度的胰岛素抵抗、胰腺细胞功能cannulated medical devices障碍、低度炎症、肠道菌群失调以及其他在遗传和环境因素交互作用下的内分泌紊乱。目前,大多数患者需要口服药物和注射疗法来控制血糖。口服药物尤其是中药在体内必然要接触肠道菌群,其治疗效果与肠道菌群的作用密切相关。目前,大部分相关研究集中于中药对于肠道菌群的调节作用,而关于在中药治疗中起关键作用的靶肠道菌的报道较少。中药黄芪、灵芝、桦褐孔菌及苦瓜均报道有调节血糖的作用,在前期研究中课题组已经发现将四者配伍成中药组方黄芪灵桦散(Huang-Qi-Ling-Hua-San,简称HQLHS)使用可以协助二甲双胍等药物改善T2DM患者的症状,但其作用机制尚未明确。本研究使用高脂饮食(High fat diet,简称HFD)和链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的T2DM小鼠模型,采用荧光定量PCR、16S r DNA测序以及代谢组学等手段,通过中药组方饲喂、粪便移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)、活菌饲喂等多轮动物实验,探讨HQLHS改善高血糖高血脂的作用机制,旨在对其在降血糖作用中潜在的靶肠道菌群进行挖掘。论文包括以下三部分的研究内容:1.HQLHS改善T2DM作用机制初步探究。利用HFD联合STZ诱导的T2DM小鼠模型,以二甲双胍作为阳性对照,探究HQLHS改善T2DM的潜在机制。结果显示,HQLHS降低了空腹血糖及空腹胰岛素的水平、改善了胰岛素抵抗、增加了肝糖原的积累、下调糖异生关键酶(Pepck和G6pc)的表达;调节血脂四项TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C的水平;降低血清中AST和ALT的水平;提高机体SOD、CAT、GSH-PX的活性,降低MDA的含量。此外,HQLHS降低了结肠Tnf-α、Il-6、Il-1β和Mcp-1的表达,减轻肠道炎症。盲肠内容物16S r DNA测序结果显示,HQLHS调节了肠道菌群结构,降低了Blautia、Klebsiella、Ruminiclostridium＿5、和Family＿XIII＿AD3011＿group等的相对丰度,增加了Turicibacter、Alistipes、Bifidobacterium、Romboustia、Ruminococcaceae＿UCG-009和uncultured＿bacterium＿f＿Christensenellaceae等的相对丰度。相关性分析表明HQLHS富集的肠道菌与血糖血脂代谢异常指标呈负相关。初步推断HQLHS通过调节肠道菌群、减轻炎症和缓解氧化应激改善T2DM。2.HQLHS富集的有益菌在改善T2DM中的作用。该部分使用了FMT方法,将HQLHS干预后的小鼠粪便移植到T2DM小鼠体内,验证了HQLHS是通过调节肠道菌群尤其上调有益菌,起到改善血糖血脂的作用。FMT除改善了血糖血脂相关生理指标外,q PCR结果还显示其下调了肝脏糖异生关键酶Pepck、G6pc的表达以及脂肪生成基因Pparγ2的表达。FMT在上调了肝脏中胆固醇分解限速酶Cyp7a1表达的同时下调了小肠内Cyp7a1的调控因子Fxr和Fgf15的m RNA水平。FMT降低了小肠内葡萄糖转运体Sglt1和Glut2的表达。ELISA测定结果显示,FMT干预后糖尿病小鼠血清中LPS的含量减少,同时,LPS的识别受体Tlr4以及Nf-κb、Il-1β、Il-6、Tnf-α在肝脏和结肠中的表达水平都显著降低。上述结果表明,HQLHS调节后的肠道菌群能够有效改善T2DM。此外,菌群分析表明Bifidobacterium、Turicibacter、Alistipes、Romboutsia和Christensenella等菌都可以稳定地被HQLHS所富集。3.Christensenella spp.改善T2DM的作用及其潜在机制研究。在该部分的研究中分别给予T2DM小鼠菌株C.minuta DSM 22607(CM)和C.timonensis DSM102800(CT),研究结果如下:(1)Christensenella spp.的干预逆转了T2DM相关的生理指标,包括空腹血糖、空腹胰岛素、口服糖耐量、血脂四项和肝糖原。CM和CT提高了血清中GLP-1的水平,并增加回肠中其前体基因Gcg的表达,表明Christensenella spp.促进了GLP-1的产生。此外,Christensenella spp.提高了糖尿病小鼠的抗氧化水平。CM显著性增加了SOD、GSH-PX的活性,CT显著性增加了CAT、SOD、GSH-PX的活性,两组均降低了血清中MDA的含量。(2)Christensenella spp.的干预改善了肝脏及肠道糖脂代谢及转运相关基因的表达。CM和CT均显著降低了肝脏中葡萄糖异生相关基因G6pc、Pepck以及脂肪生成基因Pparγ2的表达。Christensenella spp.通过调节肝脏中Cyp7a1和小肠中Fxr和Fgf15的表达调节胆汁酸循环。CM抑制了小肠中Glut2和Sglt1的表达,寻找更多从而抑制肠道中葡萄糖的吸收。(3)Christensenella spp.的干预改善了肠道稳态相关基因的表达。CM和CT均降低了血清中LPS的含量,逆转了LPS/TLR4途径上相关基因的表达,包括肝脏和肠道中Tlr4、Nf-κb、Tnf-α、Il-6、Il-1β的表达。Christensenella spp.增强了肠道屏障,表现为增加了结肠紧密连接蛋白Zo-1、Claudin-1的表达。Christensenella spp.同时增加了糖尿病小鼠回肠中抗菌肽Reg3γ、Defa的表达,从而调节肠道稳态。(4)Christensenella spp.的干预调节了肠道菌群的结构。CM显著增加Bifidobactetium、Phascolarctobacterium和Collisella的相对丰度,显著降低了Muribaculum、Ruminiclostridium＿5和Lachnospiraceae＿FCS020＿group的相对丰度。CT显著增加了Bifidobactetium,Phascolarctobacterium、Turicibacter的相对丰度,同时显著降低了Muribaculum的相对丰度。(5)Christensenella spp.的干预调节了肝脏和肠道的代谢。CM组肝脏的差异代谢物有乙醇、脂肪酸残基、单甘油酯、甘油三酯、胆碱、葡萄糖1磷酸、葡萄糖、甘油磷酰胆碱和犬尿酸。CT组肝脏的差异代谢物有乙醇、脂肪酸残基、单甘油酯、甘油三酯、葡萄糖1磷酸、葡萄糖、牛磺酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、犬尿酸、色氨酸和酪氨酸。CM组肠道差异代谢物为丁酸、胆碱、甘油磷脂酸胆碱、马尿酸、肌醇、肌酸、乙醇、谷氨酸、异亮氨酸、犬尿酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸。CT组肠道差异代谢物为乙酸、丁酸、马尿酸、肌酸、乙醇、犬尿酸和苏氨酸。代谢通路分析表明,CM和CT均显著影响了肝脏中淀粉和糖代谢通路以及三羧酸循环,CM显著调节了肠道中半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路,CT显著调节了肠道磷酸肌醇代谢通路。综上所述,本研究利用HFD和STZ诱导的糖尿病小鼠模型,基于肠道菌群探究HQLHS改善高血糖的作用机制。实验结果表明,中药组方通过富集肠道中有益菌发挥治疗作用。其中,Christenseselleckchemnella分类群作为一种响应HQLHS干预的显著性生物标志物被识别并筛选出来,并通过活菌饲喂验证了Christensenella是黄芪灵桦散作用的靶肠道菌。同时本研究对Christensenella spp.改善血糖血脂的潜在作用机制进行初步探究,体现为促进小肠中GLP-1的分泌、提高机体抗氧化能力、抑制肝脏糖异生、抑制葡萄糖在小肠中的吸收、增强肠道屏障、减轻LPS诱导的炎症反应以及调节肝脏和肠道代谢产物。

目的Laduviglusib：比较分析刺玫籽油的品质及抗氧化活性与可食用的红松仁油、花生油的差异性。方法：从理化性质、主要成分的含量及体外抗氧化活性分析刺玫籽油与花生油、红松仁油的差异性。结果：相比于花生油及红松仁油，刺玫籽油具有较低的过氧化值、高碘值，而酸值与皂化值无显著性差异。刺玫籽油的α-亚麻酸及亚油酸的含量显著高于花生油及红松仁油，油酸含量显著高于花生油而低于红松仁油；刺玫籽油含有多酚及生育酚的量均显著高于花生油及红松仁油，但黄酮含量无显著性差异。进一步的体外抗氧化活性分析结果发现，刺玫籽油清除ABTSsandwich type immunosensor自由基及DPPH自由基的能力均强于花生油及红松仁油，且对自由基的清除率具有显著性差异；刺玫籽油清除超氧自由基及羟基自由基的能力强于花生油，弱于红松仁油，但清除率无显著性差异；刺玫籽油的还原力均强于花生油及红松仁油，但无显著性差异。结论：相较于花生油及红松仁油，刺玫籽油更具有作为天然抗Tofacitinib化学结构氧化剂的优势，可为刺玫籽油进一步开发利用奠定实验基础。

目的：探究注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂(铭复乐)联合依诺肝素对急性ST段抬高型心肌梗死的治疗效果。方法：选择2018年1月～2022年2月收治的急性ST段抬高型心肌梗死患者的临床数据，共120例。全部AZD1152-HQPA纯度病患均经心电图检测确诊为急性ST段抬高型心肌梗死，并且病患发病时间≤6 h。随机分为对照组和观察组，每组各60例。全部病患均给予抗血小板治疗(阿司匹林300 mg+氯吡格雷300 mg)和抗凝治疗(依诺肝素30 mg静推：溶栓后15 min内于皮下注射40 mg)。对照组在此基础上给予阿替普酶，首剂8 mg,静推，继60 min内泵注42 mg。观察组在此基础上给予16 mg铭复乐静推。对比两组直接再通率、间接再通率、出血情况及院内治疗期间的心血管事件发生情况和死亡事件发生情况。结果：观察组间接再通率与直接再通率差异无统计学意义(P>0.05)。研究组中1例患者消化道出血，出血率1.67%,对照组中3例皮肤黏膜出血，1例血尿，1例消点击此处化道出血，出血率为8.33%,研究组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组心肌梗死后心绞痛发生率为25.00%(15例),观察组心肌梗死后心绞痛发生率明显低于对照组(P<0.05)。观察组死亡率与对照组AM symbioses比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：相较于使用依诺肝素联合阿替普酶的用药方式，依诺肝素联合铭复乐对急性ST段抬高型心肌梗死具有更理想的治疗效果，这种联合用药方式安全、有效，可以降低病患的出血情况、心肌梗死后心绞痛的发生情况以及死亡情况，可用于急性ST段抬高型心肌梗死常规药物治疗手段。

目的 探究血小板与淋巴细胞比值联合IL-33对早期胃癌的诊断价值。方法 选取46例早期胃癌患者(胃癌组)、42例胃良性病变患者(病变组)和40例健康体检者(对照组)为研究对象。从医院病历系统调取所Biomathematical model有患者及对照组人员的一般资料，患者入院第二天(对照组于体检当天)采集患者空腹静脉血5 mL,分析测定IL-33,检测白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血小板水平。并绘制受试者操作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC)。结果 胃癌组患者的幽门螺杆菌感染率最高，淋巴细胞计数最低，血小板与淋巴细胞比值(platelet to lympGSK2118436hocyte ratio, PLR)、IL-33水平最高(P<0.05);早期胃癌患者的年龄≥60岁、肿瘤直径≥3 cm、分化程度低者，IL-33水平显著提高(P<0.05);早期胃癌患者的年龄≥60岁、肿瘤直径≥3 cm者，PLR水平显著提高；PLR诊断早期胃癌的截断值为122,ROC曲线下面积AUC(0.95CI)为0.725(0.508～0.925);IL-33诊断早期胃癌的截断值为185 ng/mL,ROC曲线下面积AUC(0.95CI)为0.757(0.554～0.951);联合检测诊断早期胃癌的ROC曲线下面积AUC(0.95CI)为0.809(0.691～0.918)此网站。联合诊断效能显著高于单独诊断。结论 临床上对早期胃癌患者PLR和IL-33的水平进行有效的监测，并对二者的诊断效能进行联合分析，能够辅助临床医师对患者的疾病发生发展进行判断，值得临床借鉴。

目的 探讨晚期肿瘤卧床患者深静脉血栓预防中低分子肝素的价值。方法 回顾性分析2020年1月—2021年12月太仓市第一人民医院肿瘤内科晚期卧床肿瘤60例患者的临床资料，依据深静脉血栓预防方法分为低分子肝素组、巴曲酶预防组，各30例。统计分析两组深静脉血栓发生情况、实验室指标、日常生活能力、不良反应发生情况、AMG510治疗满意度。结果 低分子肝素组深静脉血栓发生率3.33%低于巴曲酶预防组26.67%，差异有统计学意义（χ~2=4.706,P<0.05）。用药后，低分子肝素组血小板计数、纤LBH589使用方法维蛋白原定量、D-二聚体水平低于巴曲酶预防组，凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间长于巴曲酶预防组，血红蛋白水平及MBI评分高于巴曲酶预防组，差异有统计学意义（P<0.05）。低分子肝素组的不良反应总发生率6.67%低于巴曲酶预防组的26.67%，差异有统计学意义（χ~2=4.320,P<0.05）。低分子肝素组治疗满意度86.67%高于巴曲酶预防组的63.33%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 晚期肿瘤卧床患者深静脉血栓预防中低分子肝allergy immunotherapy素的价值较常规性预防高。

目的 分析超声乳化白内障吸除术联合人工晶状体植入术治疗晶状体悬韧带异常继发性闭角型青光眼的效果。方法 84例晶状体悬韧带异常继发性闭角型青光眼患者,随机分为对照组和观察组,各42例。两组均给予超声乳化白内障吸除术,对照组联合小梁切除术治疗,观察组联合人工晶状体植寻找更多入术治疗。比较两组手术前后的视力改善情况、眼压、前房深度,并发症发生情况。结果 术前,观察组视VP-16采购力(0.08±0.03)与对照组的(0.08±0.02)比较,差异无统计学意义(t=0, P=1>0.05)。术后,观察组视力(0.61±0.16)高于对照组的(0.53±0.14),差异有统计学意义(P<0.05)。术后,观察组眼压(14.68±6.46)mm Hg(1 mm Hg=0needle prostatic biopsy.133 kPa)低于对照组的(18.35±6.25)mm Hg,前房深度(2.32±0.49)mm高于对照组的(2.00±0.32)mm,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组并发症发生率4.76%低于对照组的19.05%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 给予晶状体悬韧带异常继发性闭角型青光眼患者超声乳化白内障吸除术联合人工晶状体植入术治疗能够显著提升临床疗效和安全性,具有推广价值。

目的 探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)患者化疗后发生医院肺部感染的相关因素。方法 回顾性分析河南省肿瘤医院2019年1MK-2206小鼠月至2022年1月收治的167例PTCL患者的临床资料，根据化疗后是否并发医院肺部感染将其分为并发组(52例)和未并发组(115例)。采用单因素和多因素logistic回归分析PTCL化疗后并发医院肺部感染的危险因素，并绘制森林图进行logistic结果的可视化显示。结果 单因素分析结果显示Algal biomass并发感染组和未并发感染组性别、体重指数、饮酒史、糖尿病史、高血压史、高脂血症、病理类型比较差异无统计学意义(P>0.05确认细节);并发组年龄≥60岁、吸烟史、肿瘤病程≥30 d、应用糖皮质激素、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、使用2种及2种以上化疗药物、血白蛋白<30 g·L~(-1)患者占比高于未并发组(P<0.05),首次治疗患者占比低于未并发组(P<0.05);多因素logistic回归分析显示，年龄≥60岁、吸烟史、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、2种及2种以上化疗药物、血白蛋白<30 g·L~(-1)是PTCL患者化疗后并发医院肺部感染的危险因素(P<0.05),首次治疗为其保护因素(P<0.05)。结论 年龄≥60岁、吸烟、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、多次治疗、使用2种及2种以上化疗药物、血白蛋白<30 g·L~(-1)与PTCL患者化疗后易并发医院肺部感染密切相关。

研究背景人肝缺血再灌注损伤(HIRI)是肝脏手术后相对常见且严重的并发症,主要发生在肝部分切除术、创伤、失血性休克复苏、肝移植术等临床过程中。人体肝脏缺血再灌注损伤是对近十年来研究内容的重要回顾,也是人体肝脏手术中遇到的技术难题,与大多数患者的治疗和预后高度相关。肝细胞的损失是肝I/R损伤后将发生肝衰竭的关键指标,因此,减少肝细胞死亡的治疗可能有效减缓肝脏I/R损伤的发生和进展。越来越多的研究人员发现,铁死亡是缺血再灌注损伤中最重要的细胞死亡形式之一,而出乎意料的是,有关铁死亡与肝脏缺血再灌注损伤相互作用的研究还处于早期阶段。目前对于HIRI的防治有多种措施,如药物、低温处理等,各有优劣。近年来研究发现在多种哺乳动物IRI模型中,丙泊酚通过抑制炎症反应、细胞凋亡等特点减轻IRI,保护心、脑、肝、肺多种器官。然而相比于其他器官,丙泊酚对肝缺血再灌注损伤机制研究较为缺乏。Nrf2/Gpx4信号通路在抑制铁死亡中起着核心作用。此外,在各种氧化应激模型中,包括肺损伤、心、脑缺血再灌注损伤中,丙泊酚被认为可上调Nrf2表达并抑此网站制氧化应激。然而,丙泊酚是否通过抑制肝细胞铁死亡来预防HIRI的发生尚不清楚,需要进一步的研究。研究方法(1)将20只C57BL/6小鼠随机分为4组,分别为假手术组Temple medicine(Sham组)、肝脏I/R模型组(HIR组)、丙泊酚+肝脏I/R治疗组(P+HIR组)、丙泊酚+Nrf2抑制剂(ML385)+肝脏I/R组(P+M+HIR组)。采用70%肝缺血再灌注损伤模型。丙泊酚在血管夹闭前15min腹腔内注射50mg/kg。(2)生化法检测血清ALT、AST含量。(3)取肝左叶组织,经石蜡包埋后采用HE染色,用于组织病理学检查。(4)生化法检测肝组织中MDA、SOD、GSH、Fe2+水平。(5)酶联免疫吸附法检测血清TNF-Torin 1 NMRα、IL-6、IL-1β水平。(6)免疫印迹试验检测Nrf2、Gpx4、SLC7A11蛋白表达。(7)免疫荧光检测Gpx4、SLC7A11表达。(8)电镜下观察线粒体形态改变。研究结果小鼠肝脏70%缺血再灌注后,异丙酚预处理可减轻肝损伤,具有抗炎和抗氧化应激潜能,减少炎性细胞浸润以及减少肝细胞铁死亡。另外,本研究还证明丙泊酚可以促进Nrf2的核易位从而促进Gpx4蛋白表达而减轻HIRI。研究结论本研究是首次证实丙泊酚通过抑制铁死亡来保护肝脏免受缺血再灌注损伤。丙泊酚介导的抗铁死亡的潜在机制可能归因于Nrf2/Gpx4信号通路的激活。

目的 探讨小阴唇肥大合并阴蒂包皮过长同期整形手术的临床效果。方法 2020-2022年福建医科大学附属漳州市医院整形美容科治疗小阴唇肥大合并阴蒂包皮过长患者60例均采用先弧形切除过长的阴蒂包皮，使之转化为单纯小阴唇肥大，再行小阴唇边缘线性切除手术。术后随访观察恢复情况及患者的满意率。结selleckchem JQ1果 共纳入60例患者,年龄20-45岁,平均27岁。其中单侧小阴唇肥大合并单侧阴蒂包皮肥大4例(6.7%),单侧小阴唇肥大合并双侧阴蒂Biopartitioning micellar chromatography包皮肥大3例(5%),双侧小阴唇肥大合并单侧阴蒂包皮肥大9例(15%),双侧小阴唇肥大合并双侧阴蒂包皮肥大44例(73.3%)。共R428溶解度获得55份术后6个月患者满意度调查问卷,5例失访,2例患者出现术后并发症，其中血肿1例,瘢痕增生伴明显疼痛1例,进行相应处理后,所有患者术后恢复良好。并发症发生率为3.6%(2/55),患者总体满意率94.5%(52/55)。结论 采用弧形切除过长阴蒂包皮，同时采用边缘线性切除处理小阴唇肥大，术后外观满意，并发症无增加，手术难度下降。