非洲猪瘟(African swine fever,ASV)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种家猪出血性病毒疾病,具有高度传染性和致命性,是世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)必须报告的法定传染病。2018年我国辽宁省沈阳市报道了首例高毒力基SAHA生产商因II型非洲猪瘟感染病例,此后以极快的速度在全国蔓延传播,使得生猪数量骤降,猪肉价格迅速上涨,对养猪业造成了极大的经济损失,同时也影响了人民的正常生活。目前尚无针对这种病毒的有效疫苗或药物,ASFV成为难以攻克的病毒之一,目前ASF防控主要是扑杀和严格的消毒措施,及早发现从源头控制ASF疫情是主要的防控措施,因此,建立一种快速省时且反应灵敏的早期检测ASFV方法至关重要。K205R是一种在ASFV感染早期表达的非结构蛋白,在ASFV感染的整个时期的诊断中均具有良好的抗原性,可以诱导猪体产生特异性血清抗体,是建立ASFV血清学检测方法较为理想的靶蛋白。纳米抗体(Nanobody,Nb)是一种存在于骆驼科动物体内,仅含重链Ig G抗体的抗体片段,具有分子量小、结构简单、抗原结合亲和力高等优点,被广泛应用于疾病诊断和治疗领域,然而,纳米抗体在动物疾病诊断和治疗方面鲜有报道。本研究将纯化后的Flow CytometersK205R蛋白免疫雄性双峰驼,通过噬菌体展示技术成功筛选到5株针对K205R蛋白的特异性纳米抗体,构建了一个操作简单且快速表达Nbs-HRP融合蛋白的平台,利用融合蛋白作为检测探针开发一种快速省时且具有高灵敏度的c ELISA检测方法,本研究的主要内容和主要研究结果如下:1.ASFV-K205R蛋白的表达与纯化将构建成功的重组质粒p ET-30a-ASFV-K205R转化入BL21(DE3)表达感受态细胞,IPTG诱导表达后获得了包涵体形式表达的蛋白,经Ni-NTA纯化后,获得了高浓度的K205R重组蛋白,将其用于双峰驼的免疫。2.VHH噬菌体文库的构建与ASFV K205R蛋白特异性纳米抗体的筛选对第五次免疫后的双峰驼进行血液采集,提取外周血淋巴细胞的总RNA并反转录,以此为模板使用巢式PCR扩增VHH基因,插入p CANTAB 5E噬菌体载体中,电转至TG1感受态细胞,通过3轮拯救和生物淘选最终筛选到5株抗K205R蛋白的特异性纳米抗体,ELISA检测结果分析表明Nb1,Nb35和Nb82的结合力最强。3.竞争ELISA检测方法的建立与评估将Nbs克隆入p CAGGS载体,真核表达载体的重组质粒转染HEK293T细胞,收集在细胞上清中分泌表达的纳米抗体。ELISA检测结果显示三株纳米抗体都能够阻断K205R蛋白与阳性血清反应,其中Nb1的阻断率较高,选择Nb1作为检测探针建立竞争ELISA检测方法,对各反应条件进行优化,利用建立的c ELISA检测方法确定了Cut-off值为34.8%,特异性高且灵敏性,板内变异系数为2.23%-8.45%,中值为5.34%,板间变异系数为3.71%-10.9%,中值为7.31%,与商https://www.selleck.cn/products/sbe-b-cd.html品化试剂盒的符合率达99.3%。综上所述,本课题研究筛选到5株针对ASFV K205R蛋白的特异性纳米抗体,最终以Nb1作为检测探针,建立了一种快速检测猪血清抗体的竞争ELISA检测方法,该方法具有生产成本低廉,操作简单,耗时短等优点,在临床猪血清ASFV抗体检测中具有广阔的应用前景。