脑胶质瘤是中枢神经系统难治性肿瘤类型之一,其中胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)的恶性程度最高,由于其侵袭性生长特性,GBM与正常脑组织基本没有明确的边界,容易导致手术切除selleck化学不彻底,术后复发及放化疗抵抗现象明显。因此,寻求新的医治策略是临床GBM治疗亟需解决的关键问题。近年来,随着科研人员对肿瘤表观遗传学的深入探索,大量研究证实环状RNA(circularRNA,circRNA)不仅在GBM组织/细胞恶性进展中存在显著的失调表达,还在调控肿瘤侵袭、自噬、化疗耐药以及上皮间充质转化等恶性生物学表型方面也发挥着重要作用。circRNA介导的表观遗传学调控一跃成为当下肿瘤学基础研究中炙手可热的探索方向,circRNA也成为GBM靶向治疗领域新兴的研究靶点,应用潜力巨大。总而言之,靶向这些天然存在的circRNA是一种非常有前途的脑肿瘤治疗方式,这对于改善GBM临床治疗现状具有重要意义。核酸类药物如小干扰RNA(Small interferingRNA,siRNA)作为生物医药领域的研究热点,已被广泛应用于探索基因功能以及恶性肿瘤的核酸药物治疗。siRNA作为RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的效应分子,对于具有特殊环形结构的circRNA,RNAi技术也被证实是特异性阻断基因表达的有效方法,其可以根据circRNA反向剪接位点序列或内含子区域序列来设计高度特异性的siRNA分子,以防止对亲本基因的敲低。尽管RNAi疗法在GBM基础研究上已取得突破性进展,但想要真正转化为临床安全用药仍面临诸多挑战(血液稳定性、血脑屏障穿透及原位病灶有效释放等)。因此,安全高效的体内递送仍然是制约RNAi疗法应用的最大障碍。基于此,采用纳米技术构建核酸药物递送系统将是解决这一问题的重要手段和途径。这些具有独特表征的纳米尺度载体不仅可以防止治疗性核酸分子被降解,使其从体循环中穿透血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)或细胞生物屏障,还可以通过载体的表面修饰与细胞膜上的受体发生结合来实现靶向运输,使核酸治疗分子精准作用于靶细胞。在GBM治疗方面展现出显著优势,为克服核酸类药物的循环时间短及无法靶向肿瘤细胞等缺点提供了新的解决方案。本研究以“circRNA介导的表观遗传学调控”以及“RNAi肿瘤疗法”这两个热门研究方向作为切入点,结合Angiopep-2修饰聚合物纳米胶束的稳定性、生物相容性、生物可降解性、低细胞毒性以及对BBB和GBM的靶向性等重要分子特性,提出“RNAi纳米核酸药物通过circRNA/ceRNA途径在GBM靶向治疗中发挥抑癌作用”的科学假设。研究目标:GBM作为常见的致命性恶性肿瘤,抑癌基因和癌基因的表达紊乱是导致GBM生物学特性改变的根本原因。基于课题组前期全转录组测序联合生信分析,进一步丰富了GBM表观遗传学调控的互作网络,为GBM靶向治疗提供了有效靶点,并筛选合成了核酸药物分子(治疗性siRNA)。此外,设计构建了一种经Angiopep-2修饰的嵌段共聚物胶束(PHB-PDMAEMA)作为核酸药物载体,在PHB-PDMAEMA中,PHB片段可以与多肽Angiopep-2通过脱羧反应相互结合,PDMAEMA片段可以依靠静电力作用吸附治疗性siRNA,形成多聚物/基因复合体(RNAi纳米药物)。该RNAi纳米药物可以与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1)膜受体结合介导靶向BBB和GBM,特异性降低细胞中致癌基因circ＿TNFRSF19的表达水平,进而通过其介导的竞争性内源RNA(competing endogenousRNA,ceRNA)调控机制在GBM恶性进展中发挥抑癌作用。综上,本研究首次尝试使用Angiopep-2修饰的PHB-PDMAEMA作为核酸药物载体,介导治疗性siRNA靶向逆转GBM细胞中内源性circ＿TNFRSF19的失调表达,从而抑制肿瘤恶性生物学行为。一方面实现以多聚物纳米胶束为核酸药物载体的稳定交互平台,深入挖掘纳米医学在临床疾病治疗中的实用价值;另一方面证实circRNA介导的表观遗传调控机制在肿瘤治疗中的新兴作用,进一步推动基于circRNA的RNAi疗法。为GBM靶向治疗提供新思路。研究方法:(1)基于5组临床术后GBM组织和外伤减压正常脑皮质组织开展全转录组测序研究,并针对基因测序结果进行高级生物信息学分析。构建circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络,选取互作网络中关键circRNA分子,利用RT-qPCR技术进行基因表达水平验证,最终获得目标circRNA。(2)基于RNAi技术以及RT-qPCR验证实现circRNA敲低。利用Ed U、Transwell及流式细胞Western Blotting术实验对目标circRNA进行细胞功能实验筛选。制备RNAi纳米药物,利用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射仪、透射电子显微镜和CCK-8技术测定RNAi纳米药物的稳定性、ROS响应能力、p H响应能力及细胞毒性。(3)构建BBB以及3D肿瘤球体外模型,利用流式细胞术、Transwell实验及激光扫描共聚焦显微镜对RNAi纳米药物的靶向性(细胞摄取、BBB穿透以及肿瘤组织渗透)进行检测。RT-qPCR、CCK-8、Transwell及流式细胞术检测实验进一步验证RNAi纳米药物的基因沉默和抗肿瘤效果。生物信息学分析预测并通过RT-qPCR和Western Blot验证circ＿TNFRSF19的下游靶基因。研究结果:(1)与非肿瘤对照组相比,来自GBM样本总共发现了5341个差异表达(DE)mRNA、259个DEmiRNA、3122个DElncRNA和2135个DEcircRNA。此外,整合构建了circRNA/lncRNA-mPR-171核磁iRNA-mRNA ceRNA调控网络,并以此为基础,筛选出5个表达上调的circRNA。通过RT-qPCR验证,确定3个兴趣分子作为后续实验研究的初步候选circRNA。(2)siRNA瞬转敲低U343细胞模型构建成功。目标circRNA(circ＿TNFRSF19)表达水平下调后,GBM细胞的恶性生物学行为受到显著抑制。此外,成功制备了PHB-PDMAEMA核酸药物递送载体,其可吸附siRNA形成稳定的多聚物/基因复合体。并且能在高H_2O_2或弱酸性(体外模拟肿瘤微环境)条件下发生降解,快速释放出siRNA分子。(3)Angiopep-2修饰的RNAi纳米药物可与LRP-1膜受体结合主动靶向BBB与GBM细胞,与非靶向修饰组相比,其细胞摄取、BBB穿透和肿瘤组织渗透能力最强。此外,它还被证实能够显著降低GBM细胞中circ＿TNFRSF19的表达水平及增殖、迁移和侵袭能力,并促进肿瘤细胞凋亡。主要机制是circ＿TNFRSF19作为ceRNA分子发挥miRNA分子海绵作用,通过调节GBM细胞中mi R-324-3p/Bcl-2轴来诱导细胞凋亡。研究结论:(1)本研究借助全转录组测序技术深入探究了GBM的发病机制,构建circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA互作网络图,进一步揭示了非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)介导的表观遗传调控与GBM恶性转化之间的潜在关联。这些发现不仅展示了GBM基因组的复杂性,同时也为寻找GBM基因治疗相关靶点提供了证据,靶向纠正肿瘤恶性形成过程中内源性circRNA的失调表达,将是克服GBM治疗瓶颈一种理你想的治疗策略,具有重要意义。(2)敲减circ＿TNFRSF19表达可以显著抑制GBM细胞的增殖、侵袭和迁移,同时促进其凋亡。PHB-PDMAEMA聚合物纳米载体可以稳定吸附siRNA形成聚合物/基因复合体。并且其具备ROS和p H双重响应能力,能在高H_2O_2或弱酸性(体外模拟肿瘤微环境)条件下发生解聚,快速释放出核酸分子,显著提高了siRNA生物利用度。并为后续深入探讨RNAi纳米药物在GBM靶向治疗中的抑癌作用及相关机制研究提供实验基础。(3)Angiopep-2修饰的RNAi纳米药物具备主动靶向功能,不仅能够穿越BBB还可以主动靶向GBM细胞,深层渗透至肿瘤组织内部。此外,其还具有良好的基因沉默和抗肿瘤效果,通过沉默circ＿TNFRSF19显著抑制GBM细胞增殖、迁移和侵袭恶性进展表型,并促进肿瘤细胞凋亡。其潜在机制是circ＿TNFRSF19发挥分子海绵功能通过mi R-324-3p/Bcl-2信号途径显著促进RNAi纳米药物诱导的细胞凋亡。总之,本研究首次尝试使用Angiopep-2修饰的PHB-PDMAEMA作为核酸药物载体,介导治疗性siRNA分子通过调控circ＿TNFRSF19/mi R-324-3p/Bcl-2信号轴,在GBM恶性进展中发挥抑癌作用。不仅为GBM的RNAi疗法提供了新的靶点及理论依据,也为GBM靶向治疗提供了一个良好的交互平台,展示出纳米医学在未来肿瘤治疗领域中的广阔前景。