目的:哺乳动物腭的发生包括腭突垂直生长、快速上抬、水平生长直至接触融合。90%的腭裂是腭突上抬异常导致的。维甲酸(Retinoic acid,RA)是维生素A的功能活性衍生物,怀孕母亲过量RA的摄入会导致胎儿腭裂的发生,利用RA诱导的小鼠腭裂模型也是研究腭裂最经典的动物模型之一。以往的研究表明过量RA通过延迟腭突上抬导致腭裂的发生,但其潜在的生物学机制尚无统一说法。课题组在氯化锂诱导的腭裂小鼠模型中发现腭间充质细胞骨架收缩在腭上抬阶段的关键作用,这可能为快速的腭上抬过程提供合理的解释。然而,这一观点是否能普遍解释其他模型中的这种腭上抬延迟仍有待确认。因此,本研究旨在于RA诱导的小鼠腭裂模型中,进一步验证非经典Wnt信号通路关键配体Wnt5a调节的细胞骨架收缩在调控腭突上抬过程中的具体作用机制,为腭裂的预防及治疗提供理论参考。方法:本研究利用全反式维甲酸建立腭裂小鼠模型,收集胎鼠头部制做石蜡切片进行HE染色,形态学观察RA诱发腭裂的特征;Ki67和TUENL检测RA对胎鼠腭突细胞增殖和凋亡的影响;利用原位杂交技术检测Wnt信号通路及下游相关基因的表达。体外实验以腭突间充质细胞为模型,利用细胞划痕实验和鬼笔环肽染色检测RA对细胞迁移能力及细胞骨架的影响。用Wnt5a激动剂Foxy5干扰Wnt5a及下游信号分子的表达,进一步验证细胞迁移能力和细胞骨架的变化。结果:HE染色和体式显微镜观察显示:持续低剂量RA(40 mg/kg)在E11.5、E12.5、E13.5连续刺激孕鼠后,孕鼠胚胎腭裂发生率为100%,未发生明显的胚胎吸收或其他畸形。Ki67和TUNEL检测显示:RA组腭突细胞增殖和凋亡未见显著性差异。RA刺激后细胞增殖的变化主要集中在前份鼻侧上皮和腭突后份。RA刺激后腭突中未发现明显的细胞凋亡,细胞凋亡主要集中在上颌区。原位杂交结果显示:RA下调Wnt5a介导的非经典Wnt信号。RA组胚胎腭间充质中经典Wnt信号关键基因β-Catenin、Axin2和Lef1的m RNA水平没有显著变化,寻找更多β-Catenin仅在腭突前份和中份的凹陷区检测到少量减少;经典Wnt信号的分泌拮抗剂Dkk2的表达仅在腭突后份略有改变;在对照组胚胎中,非经典WPF-03084014研究购买nt信号通路主要配体Wnt5a的表达沿腭突前后轴呈梯度分布,RA处理后腭突中Wnt5a基因的表达明显下调,尤其在腭突的前份和中份。非经典Wnt信号通路的主要受体Ror2在腭突前、中、后份间充质中的m RNA水平也显著降低。细胞Microscopy immunoelectron免疫荧光染色显示:Foxy5提高了Wnt5a的表达水平。与体内实验结果一致,过量RA可使Wnt5a水平下降,而RA+Foxy5组Wnt5a水平部分恢复。此外,CASIN组Wnt5a水平明显提高,RA+Foxy5+CASIN组Wnt5a水平相对下降。RA组和CASIN组中Cdc42表达水平均显著降低,Foxy5组Cdc42表达水平显著升高。虽然在RA+Foxy5组中,Foxy5部分恢复了RA引起的Cdc42的减少,但在RA+Foxy5+CASIN组中,这种减少随着CASIN的刺激而再次出现。细胞划痕愈合实验和鬼笔环肽染色显示:RA刺激导致腭间充质细胞细胞骨架应力纤维变短、方向紊乱,细胞迁移被抑制,这种作用在Foxy5刺激下部分恢复。结论(1)孕鼠在持续低剂量维甲酸(40mg/kg)刺激下,其胚胎出现100%的腭裂,同时腭突细胞的增殖和凋亡未发生明显变化。(2)在持续低剂量维甲酸诱导的小鼠腭裂模型中,维甲酸主要抑制了非经典Wnt信号通路Wnt5a-Ror2基因的表达,同时抑制了腭间充质细胞的迁移能力和细胞骨架的方向性重塑。(3)在持续低剂量维甲酸诱导的小鼠腭裂模型中,非经典Wnt信号通路主要配体Wnt5a可调节Cdc42/F-actin细胞骨架方向性重塑,改变腭间充质细胞迁移能力,影响腭突上抬。