研究背景和目的:胆囊神经内分泌癌是一种高度侵袭性且致死性较高的恶性肿瘤,容易侵犯周围的器官且容易远处转移,是胆道生存率最低的恶性肿瘤。尽管在胆囊癌中,胆囊神经内分泌癌仅占2%的比例,但由于该病起病隐匿,无特异临床表现,且缺乏高效的特异性诊断标志物,因此术前易误诊为胆囊腺癌。绝大多数患者确诊时就已失去外科根治性切除机会。该病预后差,放化疗等治疗方式治疗效果有限,晚期患者的5年生存率甚至不足10%。因此,如何改善胆囊神经内分泌癌患者的预后成为了临床上一个重大的挑战。肿瘤异质性是导致胆囊神经内分泌癌发生远处侵袭、转移、复发、耐药的重要原因,也是近年肿瘤研究的热点和难点。单细胞测序技术的出现为肿瘤异质性研究带来了突破性的变革。当前,针对胆囊癌的研究主要集中于腺癌和腺鳞癌。已有少数研究应用单细胞技术尝试对胆囊腺癌和腺鳞癌微环境异质性进行了解析。这些研究发现ERBB通路突变患者肿瘤免疫逃逸机制以及有关胆囊癌发生的“炎癌转化”机制等。然而,由于胆囊神经内分泌癌发病率低,相关研究长期仅停留在个案或小样本的临床回顾性诊治经验总结上,且缺乏深度的肿瘤病理分子机制研究,使得对胆囊神经内分泌癌的认识长期停滞不前。因此,深入探讨胆囊神经内分泌癌微环境的细胞亚群构成及细胞SB431542细胞培养间的相互作用关系对于理解该病的潜在肿瘤免疫逃逸、深入了解侵袭转移和耐药分子机制、挖掘出可能的肿瘤生物标志物和治疗靶点、制定个性化的精准诊疗方案都具有重大的临床意义。本研究将运用单细胞转录组测序技术,从三个角度剖析胆囊神经内分泌癌微环境的异质性。第一部分将绘制胆囊神经内分泌癌的单细胞图谱,探讨上皮细胞的分子分型和演化规律,以期揭示胆囊神经内分泌癌的治疗抵抗机制。第二部分将剖析胆囊神经内分泌癌中免疫细胞的亚群构成及其与肿瘤细胞的相互作用,以期揭示胆囊神经内分泌癌的免疫逃逸机制。第三部分将剖析胆囊神经内分泌癌中间质细胞亚群构成及其与肿瘤细胞的相互作用,以期揭示其侵袭转移机制。通过解析胆囊神经内分泌癌独有的微环境特征,本研究旨在发现潜在的肿瘤生物标志物和治疗靶点,为最终实现胆囊神经内分泌癌的个体化精准治疗提供新的视角。研究方法:本研究对4例胆囊神经内分泌癌、4例胆囊腺癌和3例慢性胆囊炎患者的组织原发灶样本进行了10X Genomics 3’端单细胞转录组测序。原始数据经过Cellranger处理,Seurat对下游基因表达矩阵进行细胞类型鉴定、分群及不同细胞亚群在不同病理类型来源的样本中数量分布情况分析。infer CNV用于鉴定上皮细胞良恶性,Monocle用于推断肿瘤上皮细胞之间的演化规律,Clusterprofiler用于不同细胞亚群差异表达基因富集分析,Cellchat用于细胞间网络通讯分析。研究结果:1.胆囊神经内分泌癌细胞存在显著的病理组织学特异性和高度的瘤间、瘤内异质性。我们首次发现其包括NEC＿A+、NEC＿N+、NEC＿A-N-、NEC＿A+N+和NEC＿P+五种分子亚型。通过分析胆囊神经内分泌癌和腺癌细胞的基因表severe alcoholic hepatitis达特征,我们发现其在发育层级上存在密切关联,胆囊腺癌细胞可以转化为胆囊神经内分泌癌细胞。进一步的拟时间发育轨迹分析表明,神经内分泌癌细胞NEC＿A+可以转化为NEC＿A-N-或NEC＿A+N+细胞,并进而转变为NEC＿N+细胞。此外,肿瘤细胞基因表达谱分析显示NEC＿P+细胞高表达POU2F3,与其他四种胆囊神经内分泌癌分子亚型细胞存在显著区别,提示该分子亚型可能来源于Tufts细胞。因此,胆囊神经内分泌癌细胞存在高度的异质性,不仅来源多样,而且不同亚型之间还能相互转化。这可能是胆囊神经内分泌癌抵抗当前放化疗等多种治疗方式的重要原因之一。2.胆囊神经内分泌癌免疫细胞表现出显著的异质性,不仅存在免疫“冷型”,还存在免疫“热型”肿瘤。这与胆囊腺癌免疫细胞浸润情况类似。在胆囊癌微环境中,存在一群特殊的免疫抑制细胞Tregs,这些细胞过表达CTLA4、TIGIT、TNFRSF4、ENTPD1、TNFRSF9、TNFRSF18等基因。这些细胞在微环境中高度浸润,提示微环境具有免疫抑制特征,有利于肿瘤细胞逃逸免疫攻击。值得注意的是,我们发现胆囊神经内分泌癌微环境与腺癌微环境的差异非常显著。胆囊神经内分泌癌微环境特异性显著浸润Tregs、B细胞和Na(?)ve＿CD4+T细胞,而胆囊腺癌微环境则特异性显著浸润巨噬细胞和浆细胞,且Tregs浸润程度显著低于胆囊神经内分泌癌。这表明胆囊神经内分泌癌与腺癌的免疫微环境存在显著不同,胆囊神经内分泌癌微环境具有更强的免疫抑制性,更有利于神经内分泌癌细胞逃逸免疫攻击。此外,通过细胞通讯分析,我们发现胆囊神经内分泌癌细胞通过分泌MDK分子与Tregs表面的NCL受体结合,可募集Tregs浸润微环境,诱导微环境的高度免疫抑制状态,从而使胆囊神经内分泌癌细胞逃避免疫攻击并促进肿瘤细胞的发展。3.与腺癌微环境相比,胆囊神经内分泌癌的间质细胞显著减少,提示其胞外基质阻力较低,更有利于神经内分泌癌细胞进行侵袭转移。分析间质细胞亚群时发现,my CAFs和immature ECs是胆囊神经内分泌癌间质细胞的主要亚群,而富集分析显示这些亚群与侵袭转移密切相关。细胞通讯分析表明,胆囊神经内分泌癌细胞不仅可以通过高表达DLL3配体与immature ECs表面的NOTCH1受体和my CAFs表面的NOTCH3受体结合,还可以通过高表达CD47受体与my CAFs和immature ECs表面的THBS1配体结合。这些分子相互作用可以使胆囊神经内分泌癌细胞穿透肿瘤内皮屏障并进入血管或淋巴管,从而发生远处侵袭转移。研究结论:1.首先,本研究利用sc RNA-seq技术首次剖析了胆囊神经内分泌癌微环境的独有特征,比较其与胆囊腺癌微环境的不同,并解析出5种胆囊神经内分泌癌细胞分子亚型。这5种肿瘤细胞分子亚型存在Tufts细胞和腺癌细胞两种来源,且能够相互转化,进一步揭示了胆囊神经内分泌癌抵抗当前多种治疗手段的重要原因。2.其次,与胆囊腺癌相比,我们发现胆囊神经内分泌癌微环境存在更显著的Tregs细胞浸润富集。胆囊神经内分泌癌细胞通过分泌MDK分子并结合Tregs表面的NCL受体,募集Tregs细胞浸润微环境,并诱导更强的抑制性免疫微环境。这首次揭示了胆囊神经内分泌癌相较于胆囊腺癌具有更强恶性程度的肿瘤细胞免疫逃逸分子机制。3.最后,与胆囊腺癌相比,我们还发现胆囊神经内分泌癌的间质细胞Belumosudil数量显著减少,胞外基质阻力更低。此外,胆囊神经内分泌癌细胞通过高表达DLL3和CD47分子与my CAFs和immature ECs细胞表面的NOTCH1/3、THBS1分子结合,介导其穿透肿瘤内皮屏障,进入血管或淋巴管,首次揭示了胆囊神经内分泌癌更具侵袭性的侵袭转移分子机制。因此,本研究从单细胞层面全面剖析了胆囊神经内分泌癌独有的微环境特征,揭示出其特有的治疗抵抗、肿瘤免疫逃逸及侵袭转移的分子机制,并发现MDK、NCL、THBS1、CD47、DLL3、NOTCH1/3为胆囊神经内分泌癌的潜在治疗靶点,ASCL1、NEUROD1和POU2F3为其潜在诊断生物标志物。