研究背景:急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI),表现为肾功能短期内的快速损伤,并伴随着很高的住院率和死亡率。其中,约有29%的AKI患者发展为慢性肾脏病慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)和终末期肾脏病。目前,寻找防治AKI发展为CKD的治疗策略已成为当务之急。肾脏进行纤维化是AKI发展为CKD的主要原因,主要表现为肌成纤维细胞的增多,细胞外基质的大量积累。因此,如何有效抑制肾脏纤维化对于防止AKI-CKD至关重要。研究表明,肾纤维化过程中,周细胞是肌成纤维细胞的主要来源。周细胞,是间充质来源的细胞,主要表达血小板来源的生长因子(Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β,PDGFR-β)、硫酸软骨素蛋白聚糖Chondroitin Sulfate Proteoglycan 4,NG2)和细胞表面糖蛋白(Melanoma Cell Adhesion Molecule,CD146)。周细胞主要黏附于毛细血管内皮上,调控血流,维持血管的功能。Kramann等人表明,AKI后,周细胞的丢失,肾脏纤维化变轻,这可能也和周细胞是肌成纤维细胞的祖细胞有着密不可分的关系。因此,如何有效防止周细胞转分化为肌成纤维细胞是延缓肾纤维化的有效方法。代谢重编程,是指生理或者病理状态下,机体为了满足能量供应需求,其能量来源发生了改变。细胞分化过程中,往往伴随着能量代谢的改变。Zhao等人发现脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)和糖酵解之间稳态变化决定着皮肤成纤维细胞往肌成纤维细胞转分化,激活FAO或者抑制糖酵解可减少成纤维细胞转分化。目前AKI进展中CKD中,周细胞中代谢变化尚无研究报道。因此,本文首先观察了AKI进展至CKD中,周细胞转分化和代谢变化,接下来通过药物调控周细胞的代谢重编程,观察其对周细胞转分化的影响,并进一步探明调控周细胞代谢重编程的具体分子机制。研究目的:1.明确AKI进展至CKD中,周细胞转分化和代谢变化。2.明确调控代谢重编程是否减少周细胞转分化,延缓AKI进展至CKD。3.进一步明确调控周细胞代谢重编程的分子机制。研究方法:一、动物试验1.构建单侧缺血再灌注(Unilateral renal ischemia reperfusion injury,u IRI)模型:6-8周龄雄性C57BL/6小鼠随机做好编号。采用单侧夹闭肾脏血管30min,取材前一天切除对侧肾脏的方法构建u IRI模型,模拟人类AKI至CKD的进程,并在术后2天、7天和14天处死小鼠,收集血液和肾脏。试剂盒检测肾功能,PAS观察肾脏损伤,Masson染色和天狼星红染色观察肾脏胶原纤维的沉积,免疫荧光观察肾脏纤维化基因α-SMA,Fibronectin和Collagen I的表达。2.观察周细胞转分化和代谢变化:免疫荧光共定位观察u IRI不同时间点PDGFR-β~+周细胞、CD146~+周细胞和NG2~+周细胞是否分别转分化为α-SMA~+肌成纤维细胞。为探明转分化机制,利用PDGFR-β磁珠分选u IRI不同时间点周细胞,转录组测序分析周细胞中FAO相关基因(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gammacoactivator-1α,PGC1α)和肉毒碱棕榈酰转移酶(Carnitine palmitoyltransferase1A,CPT1A),糖酵解相关基因(己糖激酶(Hexokinase 2,HK2),丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M 2,PKM2),乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase A,LDHA)的表达情况,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)和免疫荧光共定位进一步验证周细胞中的FAO和糖酵解相关基因的表达情况,3.给与药物调控周细胞的代谢变化:分别给与PGC1α的激活剂以激活FAO或者HK2的抑制剂以抑制糖酵解,并检测周细胞转分化和肾脏纤维化相关指标。4.给与AMPK信号通路激活剂,检测周细胞FAO和糖酵解的变化、周细胞转分化和肾脏纤维化的相关指标。二、细胞试验由于肾脏中周细胞缺乏细胞系,目前常用C3H/10T1/2来研究肾周细胞的生物学功能,也被称为类周细胞。研究表明,TGF-β参与调控代谢重编程,此外u IRI模型中,TGF-β的分泌和表达明显升高,明显促进肾纤维化~([1]),因此本研究中选用TGF-β模拟体内环境。1.TGF-β刺激周细胞转分化:Western blot和免疫荧光检测纤维化相关基因表达情况。2.TGF-β诱导周细胞发生代谢重编程:q PCR和WB检测类周细胞中FAO和糖酵解相关基因表达水平,Seahorse 96XFe检测类周细胞的细胞耗氧率和细胞外酸化率,试剂盒检测相关代谢酶的活性和代谢产物。3.给与药物调控周细胞的代谢变化:分别给与PGC1α的激活剂以激活FAO或者HK2的抑制剂以抑制糖酵解,观察周细胞转分化。4.给与AMPK信号通路激活剂/抑制剂观察周细胞的FAO和糖酵解变化,以及周细胞转分化。研究结果:一、动物试验1.u IRI小鼠中,PDGFR-β~+α-SMA~+,NG2~+α-SMA~+和CD146~+α-SMA~+细胞明显增加,表明周细胞转分化为肌成chromatin immunoprecipitation纤维细胞。2.GSEA分析结果显示u IRI不同时间点周细胞中FAO相关通路均明显下调,q PCR和免疫荧光共定位结果进一步显示调控FAO的关键转录因子PGC1α和它的下游靶基因CPT1A表达降低,周细胞的FAO受损;与之相反的是,热图分析显示u IRI不同时间点周细胞糖酵解相关基因(HK2,PKM2,LDHA)表达升高,q PCR和免疫荧光共定位结果进一步显示糖酵解关键酶HK2的表达明显升高,糖酵解终产物乳酸升高,周细胞的糖酵解明显增强。3.u IRI小鼠中,PGC1α的激活剂ZLN-005明显激活周细胞中PGC1α和CPT1A的表达,增强周细胞的FAO,减少肾脏脂质沉积;HK2确认细节的抑制剂2-DG明显抑制HK2的表达,抑制周细胞糖酵解,减少周细胞中乳酸的生成;此外,激活FAO或者抑制糖酵解可以抑制PDGFR-β~+α-SMA~+,NG2~+α-SMA~+的表达,抑制周细胞转分化为肌成纤维细胞,减少肾脏纤维化,延缓AKI进展至CKD。4.从分子机制上来说,AMPK的激活剂AICAR增强周细胞的PGC1α/CPT1A信号通路,增强FAO,减少肾脏脂质沉积;同时抑制周细胞的HIF1α/HK2信号通路,抑制乳酸生成,减少糖酵解,促进周细胞糖酵解往FAO的转换;此外,AMPK的激活剂AICAR抑制周细胞转分化为肌成纤维细胞,延缓肾脏纤维化。二、细胞实验1.TGF-β诱导类周细胞α-SMA和Fibronectin的表达,促进类周细胞转分化。2.TGF-β下调类周细胞PGC1α和其下游靶基因CPT1A的表达,减少细胞耗氧量和ATP产生,降低周细胞的FAO水平;与之相反的是,TGF-β促进糖酵解关键酶HK2,PKM2和LDHA的表达,增加细胞外酸化率,促进周细胞糖酵解水平的升高。3.PGC1α的激活剂ZLN-005可以明显逆转TGF-β诱导的PGC1α和CPT1A的降低,增加细胞耗氧量和ATP的生成,增强类周细胞的FAO,减少周细胞的脂质沉积;HK2的抑制剂2-DG可以明显逆转TGF-β诱导HK2的升高,降低细胞外酸化率,减少乳酸生成,降低糖酵解水平。ZCCRG 81045体内LN-005和2-DG均可以抑制周细胞转分化。4.AMPK的激活剂AICAR增强类周细胞PGC1α/CPT1A信号通路,促进细胞外耗氧率和ATP的生成,减少类周细胞脂质沉积;同时抑制类周细胞HIF1α/HK2信号通路,减低乳酸生成,抑制糖酵解,促进类周细胞糖酵解往FAO的转换。此外,AMPK的抑制剂Compound C抑制类周细胞PGC1α/CPT1A的表达,促进HIF1α/HK2的表达,抑制糖酵解往FAO的转换。研究结论:1.AKI-CKD中,周细胞转分化为肌成纤维细胞。2.AKI-CKD中,周细胞发生代谢重编程,表现为FAO的降低,糖酵解水平的升高。3.增强FAO,抑制糖酵解有效抑制周细胞转分化,延缓AKI进展至CKD。4.AMPK是促进周细胞糖酵解往FAO转换的上游分子,具体来说,AMPK通过激活PGC1α/CPT1A信号通路进而增强FAO,同时抑制HIF1α/HK2信号通路进而抑制糖酵解。