研究背景与目的2019冠状病毒病(COVID-19)是一种由新型冠状病毒,即严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的病毒传染病。SARS-CoV-2于2019年12月首次在中国武汉被发现,随后迅速在全球传播,对人类生命健康和社会经济发展构成了严重威胁。2022年底和2023年初,SARS-CoV-2奥密克戎变异株BA.5和BF.7在我国暴发流行,时至2023年4月,新的感染病例又明显增加。疫苗是控制病毒传染病流行的最有效武器,截至2023年5月,14种COVID-19疫苗获得紧急使用许可,这些疫苗的靶抗原均为诱导中和抗体的病毒刺突蛋白(Spike)或Spike中的受体结合域(receptor binding domin,RBD),在短期内已有巨大人群接种了多剂次疫苗,其覆盖速度为前所未有。真实世界中,疫苗接种在降低COVID-19发病率和病死率方面发挥了重要作用。然而,预防SARS-CoV-2感染的效果并不理想,其原因在于病毒的快速进化和疫苗诱导保护性抗体水平的快速衰减。尤其是抗原性发生根本性变异的值得关注的突变株(variants of concern,VOCs)的出现和迅速传播,使得现有疫苗的保护效力急剧下降,接种疫苗后或病毒感染后再感染VOCs,即突破性感染(breakthrough infection)非常普遍。在此背景下,研究、开发出能诱导高水平、广谱中和抗体和长期免疫记忆的疫苗,对于帮助人类尽快走出当前疫情具有重要意义。这对于保护免疫机能衰退和具有基础疾病的老龄人口非常重要。这种疫苗应易于制备、稳定性好并在世界范围内易于获得。目前已批准用于人体的mRNA疫苗、病毒载体疫苗和灭活疫苗都难以满足这些条件。重组亚单位疫苗制备工艺成熟,且具有低成本、易于大规模生产和储运方便等特点,是目前已批准上市的其他类型疫苗所不能比拟的。佐剂是影响重组疫苗免疫保护效果的一个关键因素,探索新佐剂,尤其是将已有临床试验的佐剂应用于COVID-19重组疫苗的开发是一种可取的策略。尽管已有多种SARS-CoV-2 VOCs流行并不断更替,但在其诱导中和抗体的刺突蛋白中存在高度保守的中和抗体表位,即便在突变位点聚焦的RBD中也是如此,因此值得探索在高效佐剂辅助下用一种Spike抗原诱导出高水平广谱保护性抗体的重组疫苗,这也是当前研发广谱SARS-CoV-2疫苗的重要方向。疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫对SARS-CoV-2感染的保护作用均发挥重要作用,然而二者在免疫保护中的作用力度尚不清楚。在实验动物模型中明确这些指标,有助于为提高未来疫苗的有效性提供思路。新生儿、婴幼儿对SARS-CoV-2高度易感,目前无适用的疫苗,在生命早期感染SARS-CoV-2是否对机体生长和器官发育产生长期影响尚不清楚,新生儿和婴幼儿亟待有效的免疫保护措施。加强接种是当前应对SARS-CoV-2疫情持续不断的重要策略,然而,该策略面临诸多免疫学问题,如自然感染后的疫苗接种＼加强接种、接种疫苗后突破性感染、多次加强接种等不同情况下的抗体动力学与抗体中和宽度等特征均有待研究。针对上述问题,在本课题中,我们用CHO细胞重组表达的膜融合前构象SARS-CoV-2 Spike三聚体作为靶抗原,分别联合四种人用佐剂配制为候选疫苗,研究候选疫苗在小鼠和叙利亚金黄地鼠模型中的免疫原性和免疫保护效果,评估了候选疫苗的免疫保护时间、在老年个体中的保护效果、抗体的母婴传递效率、对多个奥密克戎变异株的保护效果,分析了疫苗诱导的体液和细胞免疫应答在免疫保护中的作用力度以及疫苗接种后突破性感染对抗体应答的影响。研究结果不仅为高效疫苗的开发提供了实验依据,也推进了对疫苗诱导SARS-CoV-2广谱中和抗体机制的理解。一、SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的重组表达和免疫原性鉴定研究方法1.放大培养课题组前期构建的稳定分泌表达SARS-CoV-2膜融合前构象Spike三聚体(S-2P)的CHO细胞株,收集上清,用镍亲和层析和脱盐纯化S-2P蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳以后,用考马斯亮蓝染色和免疫印迹法进行鉴定。2.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测S-2P蛋白与人血管紧张素转换酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)蛋白的结合能力;用竞争抑制试验检测S-2P蛋白对SARS-CoV-2感染Vero-E6的抑制能力。3.将S-2P蛋白分别与4种人用疫苗佐剂:Alhydrogel?Alum、ESSAI O/W 1849101、Montanide ISA 51 VG 和 Montanide ISA 720 VG 相配伍作为候选疫苗,分别命名为S-2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51和S-2P:ISA720。以肌肉注射方式免疫C57小鼠,3周后加强免疫一次,通过ELISA、竞争性ELISA和微量病毒中和试验检测免疫血清中的特异性IgG抗体滴度、免疫血清对RBD蛋白与hACE2蛋白结合的抑制能力以及中和抗体滴度。用酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测小鼠脾细胞和肺细胞在体外针对Spike S1或S2蛋白刺激时分泌干扰素γ(Interferon γ,IFN-γ)的 T 细胞频率。研究结果1.表达的SBAY 73-4506-2P蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳以后,显示为单一条带,在还原条件下分子量约为170kDa,在非还原条件下分子量>460kDa。2.S-2P蛋白可结合hACE2,浓度依赖性抑制SARS-CoV-2感染Vero-E6细胞,半数抑制浓度(Half-maximal inhibitory concentration,IC50)为 0.2638 μg/mL。3.4种候选疫苗中,S-2P:ISA720免疫诱导的S1和S2特异性IgG抗体以及中和抗体滴度均最高,免疫血清阻断RBD蛋白与hACE2蛋白结合的效力最强。4.4种候选疫苗中,S-2P:ISA51和S-2P:ISA720免疫小鼠的脾和肺细胞中检测到S1和S2特异性IFN-γ+T细胞。结论表达出了较高纯度的膜融合前构象S-2P蛋白;四种佐剂候选疫苗中,S-2P:ISA720疫苗在C57小鼠中诱导最高水平的IgG抗体及中和抗体;S-2P:ISA51和S-2P:ISA720可诱导IFN-γ+T细胞应答。二、候选疫苗在SARS-CoV-2易感小动物模型中的免疫保护研究研究方法1.分别将 S-LGX818体内实验剂量2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51 和 S-2P:ISA720 肌肉注射免疫hACE2转基因小鼠(简称为hACE2小鼠),另设置S-2P:ISA720单剂量免疫组,免疫程序同第一部分;接种第二针候选疫苗三周后用致死剂量的原型株SARS-CoV-2对小鼠进行滴鼻攻毒。检测候选疫苗在hACE2小鼠中诱导的体液免疫应答,观察病毒攻击后小鼠体重变化和存活情况,评估候选疫苗的免疫保护效果。2.将 S-2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51 和 S-2P:ISA720 组免疫血清分别过继hACE2小鼠,24 h后,用致死剂量SARS-CoV-2滴鼻攻毒。通过观察小鼠体重变化,Persian medicine检测小鼠脑组织中的病毒RNA水平和相关炎症因子mRNA水平等指标评价血清过继的保护作用。3.将S2:ISA720肌肉注射免疫hACE2小鼠,免疫程序完成后,部分小鼠取脾和肺检测T细胞应答,对其余小鼠进行SARS-CoV-2攻毒。检测S2:ISA720诱导的体液以及T细胞免疫应答,观察攻毒后的免疫保护效果,评价针对S2的免疫应答在抗SARS-CoV-2免疫保护中的作用。4.将 S-2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51,S-2P:ISA720 和 S2:ISA720 分别肌注免疫叙利亚金黄地鼠(简称地鼠),免疫程序完成后,进行SARS-CoV-2攻毒。检测候选疫苗诱导的体液免疫应答,观察攻毒后的免疫保护效果。5.将S-2P:Al,S-2P:ISA720和S2:ISA720分别肌注免疫地鼠,免疫程序完成后,进行SARS-CoV-2攻毒。监测地鼠体重变化,检测组织中病毒RNA水平和炎症因子mRNA水平,进行肺组织切片和苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色,进一步评价候选疫苗在地鼠模型的免疫保护作用。6.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫hACE2小鼠,免疫程序完成后继续饲养17周以后采血,再过1周后进行SARS-CoV-2攻毒。检测候选疫苗诱导的体液免疫应答,观察免疫保护效果,分析候选疫苗是否可诱导长效免疫保护。7.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫C57小鼠,免疫程序完成后,分离脾淋巴细胞,用流式细胞术检测滤泡辅助性T细胞(Tfh cell)(CD3+CD4+CXCR5+PD-1+)和生发中心(germinal center,GC)B 细胞(CD19+B220+CD95+GL7+)的比例。8.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫3月龄(青年鼠)和18月龄(老龄鼠)hACE2小鼠,免疫程序完成后,进行SARS-CoV-2攻毒。检测候选疫苗诱导的体液免疫应答,观察候选疫苗在老龄鼠中的免疫保护效果。9.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫雌性hACE2小鼠,免疫程序完成后进行交配受孕,幼鼠出生后,4周龄时取血,5周龄时进行SARS-CoV-2攻毒。检测幼鼠血清中的中和抗体,分析候选疫苗诱导抗体的母婴传递效率,观察幼鼠在攻毒以后的生存情况。研究结果1.四种候选疫苗中,S-2P:ISA720在hACE2小鼠诱导的RBD IgG抗体以及中和抗体滴度均最高;S-2P:ISA51和S-2P:ISA720两组免疫血清RBD IgG2b滴度/IgG1滴度比值相对较高;SARS-CoV-2攻击后,S-2P:ISA720组存活率为100%,S-2P:ISA51组存活率为85.7%,S-2P:SWE组存活率为35.7%,S-2P:Al组存活率为42.8%,S-2P:ISA720单剂量组存活率为90%。2.不同候选疫苗免疫小鼠的血清过继对致死性SARS-CoV-2攻击保护效果:S-2P:Al组、S-2P:SWE组、S-2P:ISA51组和S-2P:ISA720组血清过继后,分别有0%、40%、20%和60%的受体小鼠体重未降低,且脑组织中未检测到病毒RNA和明显的炎症因子mRNA变化。3.S2:ISA720免疫hACE2小鼠诱导高滴度S2 IgG抗体以及S2特异性T细胞应答,然而未检测出免疫血清的中和活性;病毒攻击后,相对于PBS组,小鼠体重降低幅度减少,发病和死亡时间延迟。4.四种候选疫苗中,S-2P:ISA720免疫地鼠诱导的S1 IgG抗体以及中和抗体滴度最高。病毒攻击后,PBS组体重迅速降低,第6-7天才开始恢复;S-2P:ISA720组体重降幅最小,体重从第2天开始恢复;S-2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51和S2:ISA720免疫的地鼠在攻毒后也表现出体重降低幅度减少和恢复时间提前。5.在地鼠模型中,候选疫苗免疫后进行病毒攻击,S-2P:ISA720组肺组织病毒载量接近于检测下限,鼻甲中的病毒RNA水平相对于对照攻毒组降低近10倍,肺组织炎症因子mRNA水平无明显升高,肺组织切片染色只观察到有限的病理变化。6.对比S-2P:Al和S-2P:ISA720免疫的hACE2小鼠,在接种第二针以后的4个月内,S-2P:ISA720组血清RBD IgG抗体和中和抗体滴度均较S-2P:Al组下降明显缓慢;病毒攻击后,S-2P:Al组100%死亡,而S-2P:ISA720组100%存活。7.对比S-2P:Al和S-2P:ISA720免疫的C57小鼠,后者脾脏中Tfh细胞和GC B细胞的百分比均高于前者。8.对比S-2P:Al和S-2P:ISA720免疫的青年鼠和老龄鼠(hACE2小鼠),S-2P:Al和S-2P:ISA720在老龄鼠诱导的RBD IgG抗体和中和抗体滴度均显著低于青年鼠;病毒攻击后,青年鼠中,S-2P:Al组和S-2P:ISA720组的存活率分别为40%和100%;老龄鼠中,S-2P:Al组和S-2P:ISA720组的存活率分别为0%和40%。9.对比 S-2P:Al 和 S-2P:ISA720 免疫的雌性 hACE2 小鼠,S-2P:ISA720 免疫雌鼠交配受孕所生子鼠的血清中有较高滴度RBD IgG抗体并能有效中和病毒,病毒攻击后,子鼠发病和死亡时间延迟。结论以SARS-CoV-2膜融合前构象Spike三聚体S-2P为疫苗抗原,四种不同佐剂对于其诱导免疫应答的强度及保护效果有不同影响。ISA720佐剂辅助S-2P诱导的中和抗体水平最高,可高效保护hACE2小鼠和地鼠抵抗SARS-CoV-2攻击。候选疫苗S-2P:ISA720可100%保护小鼠抵抗致死性病毒攻击,且免疫小鼠血清过继能保护受体小鼠抵抗致死性病毒攻击。对比分析四种候选疫苗免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及攻毒保护效果,显示中和抗体在疫苗保护中起关键作用,而细胞免疫应答起辅助作用。S2:ISA720免疫hACE2小鼠和地鼠,虽未诱导中和抗体,但也对SARS-CoV-2攻击产生保护作用。相对于S-2P:Al,S-2P:ISA720能诱导持久的免疫保护,能在老龄鼠中对致死性SARS-CoV-2感染提供保护,且其诱导的中和抗体可通过母婴传递,一定程度保护幼鼠抵抗SARS-CoV-2感染。三、候选疫苗诱导针对SARS-CoV-2 VOCs的免疫应答研究研究方法1.分别将 S-2P:Al,S-2P:SWE,S-2P:ISA51 和 S-2P:ISA720 肌注免疫 hACE2小鼠,检测免疫血清对Delta和Omicron BA.1、BA.2、BA.5和BF.7变异株的中和效力。2.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫hACE2小鼠,共免疫3次,免疫程序完成后,用Omicron BA.2攻毒。检测接种加强针,即第三针以后小鼠血清中针对VOCs IgG抗体和中和抗体水平的变化。病毒攻击后,观察小鼠体重变化,检测组织中病毒RNA水平,评价候选疫苗对Omicron BA.2感染的保护作用。3.分别将S-2P:Al和S-2P:ISA720肌注免疫地鼠,免疫程序完成后,用SARS-CoV-2原型株攻毒,攻毒3周后采血。检测免疫后及攻毒后血清中的SARS-CoV-2,Delta和Omicron BA.1 RBD IgG抗体和中和抗体水平,分析突破性病毒感染对接种疫苗个体体液免疫应答强度与广度的影响。研究结果1.四种候选疫苗免疫的小鼠血清均可中和Delta变异株,S-2P:ISA720免疫小鼠血清对Omicron BA.1、BA.2、BA.5和BF.7的中和阳性率和中和抗体滴度均显著高于S-2P:Al免疫血清。2.hACE2小鼠接种2针S-2P:ISA720即诱导出较高水平的Omicron BA.2中和抗体,而S-2P:Al接种3针所诱导的Omicron BA.2中和抗体仍处于较低水平。Omicron BA.2攻击后,S-2P:ISA720免疫小鼠肺组织和鼻甲中的病毒RNA水平显著降低,而S-2P:Al免疫小鼠组织中病毒RNA水平未见明显降低。3.对比接种S-2P:Al或S-2P:ISA720的地鼠在SARS-CoV-2原型株攻毒后血清中针对原型株和Omicron BA.1的中和抗体滴度,S-2P:Al组血清的原型株中和抗体滴度显著提升,而Omicron BA.1中和抗体滴度未明显提升,S-2P:ISA720组则相反,原型株中和抗体滴度未见提升,而Omicron BA.1中和抗体显著提升。结论S-2P:ISA720 免疫 hACE2 小鼠能诱导针对 Omicron BA.1、BA.2、BA.5和BF.7变异株的交叉中和抗体;免疫的小鼠在Omicron BA.2攻毒后,呼吸道中病毒载量显著降低。S-2P:ISA720免疫的地鼠在SARS-CoV-2原型株攻毒后,血清对Omicron BA.1的中和活性显著提升;S-2P:Al免疫地鼠则不能诱导针对Omicron BA.1的交叉中和抗体,且攻毒后交叉中和抗体水平未见明显提升。总结本论文以重组SARS-CoV-2膜融合前构象Spike三聚体S-2P蛋白为疫苗抗原,研究其联合四种不同人用佐剂在病毒易感小动物模型中诱导的免疫应答特征及攻毒保护效果,为开发高效、广谱COVID-19疫苗提供了重要实验依据。联合高效人用疫苗佐剂,原型株S-2P可诱导持久、广谱免疫保护;给老龄鼠、新生鼠提供有效保护;在暴露于新变异株时,针对新变异株的中和抗体水平迅速提升。本研究提示,联用高效佐剂的重组疫苗有望克服当前疫苗的不足,实现疫苗的方便获得和高效、广谱、持久保护。