病害是水产养殖业高质量发展的关键限制因素之一。在众多水产养殖病害中,由细菌感染导致的疾病占比较大,成为限制水产养殖业发展的重要因素。在海水养殖过程中常见的病原菌包括副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、鳗弧菌(V.anguillarum)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等,selleck产品严重影响鱼、虾、贝类等水产养殖动物的健康养殖。由于水产养殖病害频发、抗生素滥用等问题,开发减抗并且对抗疾病的产品显得尤为重要。芽孢杆菌(Bacillus)是水产养殖中常用的益生菌,芽孢杆菌由于其具有净化水质、促进生长、预防疾病等特点,成为抗生素的有效替代品之一。本研究从中国海水养殖系统中收集到了具有地域多样性的120株芽孢杆菌分离株,对120株芽孢杆菌的分离株遗传多样性和抗生素特性、毒力和耐药基因型进行了评价,筛选对水产养殖病原菌具有广谱抑菌作用的芽孢杆菌并对其潜在益生菌的特性进行研究。将筛选得到的复合益生菌AVS1应用于凡纳滨对虾中,探究其在凡纳滨对虾养殖系统中的应用效果评价分析,研究使用了复合益生菌AVS1对对虾肠道菌群结构的变化,为复合益生菌在水产养殖中的研制和应用奠定了基础。本实验研究为水产养殖疾病的病害防治和益生菌的应用提供理论参考,为开发安全、有效的水产用微生态制剂奠定基础,以期能为水产养殖行业的健康绿色发展提供帮助。本文的主要研究内容和结果如下:(1)海水养殖系统中芽孢杆菌遗传及表型多样性研究。通过2009-2021年我国不同水环境中具有地域多样性的芽孢杆菌分离株,对收集到的分离株的遗传多样性和抗生素特性、毒力和耐药基因型进行了评价。120株芽孢杆菌属分离株分成24个不同的种,分别包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)等。在120株芽孢杆菌分离株中检测了包括nhe A、寻找更多nhe B和nhe C等10种毒力基因,所有分离株中仅有9株(7.5%)携带毒力相关基因,其中9/120株携带ent FM,7/120株携带hbl A和hbl C,6/120株携带nhe B,5/120株携带nhe C、cyt K和bce T。所有菌株均未检出hbl D、nhe A和ces基因。120株芽孢杆菌分离株对氟苯尼考(120/120),多西环素(120/120),氟甲喹(118/120)和四环素(116/120)等12种抗生素高度敏感;对卡那霉素(76/120)、红霉素(74/120)、新霉素(16/120)的敏感性较低。120株芽孢杆菌共检测了18种耐药基因,仅检出3种基因,其中四环素基因tet B检出120株(100%),氯霉素基因cfr检出10株(8.33%),β内酰胺类基因bla TEM检出4株(3.33%)。(2)水产养殖病原菌广谱拮抗芽孢杆菌的筛选与特性分析。本研究中发现120株芽孢杆菌对5种病原菌弧菌(V.parahaemolyticus、V.alginolyticus、V.owensii、V.campbellii、V.harveyi)显示出不同的抑菌效果。对于同种弧菌而言,芽孢杆菌分离株的抑菌能力存在差异。其中,有16株芽孢杆菌对这5种病原均具有抑菌作用。16株芽孢杆菌对其余6种病原菌(V.anguillarum、V.cholerae、V.decay、Edwardsiella tarda、V.rotiferianus、Pseudoalteromonas sp.)活性检测发现,16株均对假交替单胞菌有抑制作用,15株对霍乱弧菌有抑制作用,14株对迟缓爱德华氏菌和轮虫弧菌有抑制作用,12株对希瓦氏弧菌有抑制作用,10株对鳗弧菌有抑制作用。16株芽孢杆菌均能在酪蛋白琼脂培养基和淀粉培养基上形成透明圆环;16株芽孢杆菌中有9株在绵羊血平板上形成溶血环,表现出了溶血效应。实验通过拮抗作用及上述与病原菌的拮抗作用、蛋白酶和淀粉酶活性以及溶血活性,筛选出3株芽孢杆菌分别为Bs69(解淀粉芽孢杆菌Bam2105)、Bs61(贝莱斯芽孢杆菌Bve1710)和Bs119(枯草芽孢杆菌斯氏亚种Bspi2104)。3株菌均能够抑制V.parahaemolyticus、V.alginolyticus、V.owensii、V.campbellii、V.harveyi,各菌株还对V.anguillarum、V.cholerae、V.decay、Edwardsiella tarda、V.rotiferianus、Pseudoalteromonas sp.有不同的抑菌效果;均具有产蛋白酶和淀粉酶的能力且不具有溶血活性。(3)复合益生菌在凡纳滨对虾养殖系统中的应用效果评价。以凡纳滨对虾为研究对象,在感染副溶血弧菌24 h之后口服AVS1组的效果显著高于浸泡AVS1组,浸泡AVS1组对虾死亡率达到80%,而口服AVS1组没有出现死亡。在同时浸浴副溶血弧菌与AVS1的组中,对虾的7 d死亡率达到56.7%。在浸泡AVS1 3 d之后加入副溶血弧菌对虾开始出现死亡,死亡率为46.7%。阴性对照组只添加了复合AVS1,对虾存活率为100%。添加复合益生菌AVS1可以能显著降低对虾体内和水体内的病原菌数量,对对虾非特性免疫酶AKP、ACP、LZM、SOD、PO测定发现,复合益生菌AVS1能够提高对虾的免疫能力。组织病理切片也进一步证明了益生菌对病原微生物具有一定的抑制作用,为AVS1在水产养殖中的应用提供理论基础。(4)不同投喂方式下AVS1对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响。将筛选得到的复合益生菌AVS1应用于凡纳滨对虾中,基于16S r RNA基因测序的肠道菌群结构组成分析,α多样性分析结果发现,感染副溶血24 h后口服AVS1组和阴性对照组的Chao1指数显著高于阳性对照组和空白对照组,浸泡AVS1组和口服AVS1组、同时浸泡副溶血弧菌和AVS1组和浸泡AVS1 3 d之后加入副溶血弧菌组的Chao1指数有显著差异性(P<0.05)。所有实验组的Shannon指数、Simpson指数和Richness指数均没有显著差异性(P>0.05)。基于Bray＿Curtis算法的PCo A分析发现,口服AVS1组、同时浸泡副溶血弧菌和AVS1组、浸泡AVS13 d之后加入副溶血弧菌组和阴性对照组的组间样本距离较近,菌群结构差异较小;浸泡AVS1组与其他样本之间的距离均较远,空白对照组和阳性对照组间样品相距较近。在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenercutes)为优势菌门。浸泡AVS1组与口服AVS1组的软壁菌门有显著差异,口服AVS1组与阴性对照组的菌群结构相似,浸泡AVS1组与空白对照组和阳性对照组的结构相似;浸泡AVS1 3 d之后加入副溶血弧菌组的Patescibacteria与其他组有显著差异性。在属水平上,罗尔斯通菌属(Ralstonia)、弧菌属和海绵单胞菌(Spongiimonas)为优势属。所有实验组均添加了Porphyrin biosynthesis复合益生菌AVS1,与空白对照组和阳性对照组相比显著提高了红杆菌科的比例,在感染副溶血弧菌24 h之后浸泡AVS1组效果没有口服AVS1的效果好,口服益生菌可以明显地降低弧菌属细菌,弧菌属在浸泡AVS1组、空白对照组和阳性对照组中的比例较高,同时浸浴副溶血弧菌与AVS1组的弧菌属比例低于浸泡AVS1 3 d之后加入副溶血弧菌组;阴性对照组与空白对照组、阳性对照组的弧菌属比例有显著差异性。基于LEf Se分析的结果发现,共有不同分类水平的52个细菌群类在7个组之间存在差异性。各组内从门到属水平均存在代表性差异菌群,主要包括拟杆菌门、变形菌门和放线菌门的菌群。