棉纤维发育是一个多基因控制的高度程序化过程,对衣分(Lint percentage,LP)及纤维强度(Fiber strength,FS)相关基因的挖掘并解析其调控机制对于加快棉花的遗传改良至关重要。鉴于此,本研究以陆地棉优质品种中棉所127(CCRI127)作为共同父本分别与陆地棉高产品系EZ60与177系(L177)进行杂交,构建了2个各包含1141与1041个单株的F_2分离群体,自交加代获得F_(2:3)群体。在此基础上,采用基于高通量测序的混合分组分析(Next-generation sequencing-based bulked segregant aPLX3397纯度nalysis,NGS-BSA)对陆地棉LP及FS相关QTLs分别进行了鉴定,并对重要候选基因进行了挖掘。具体结果如下:(1)双亲棉纤维组织样本RNA-seq分析本研究对EZ60与CCRI127始花期后0、5、10、15、20与25天(Days-postanthesis,DPA)的胚珠/纤维组织样本进行了RNA-seq分析,共检测到2545个在双亲间存在差异表达的基因(Differential expression genes,DEGs),可根据表达动力学模型聚为5个不同的功能群(Clusters)。DEGs显著富集的GO terms均与细胞膜、细胞壁生物合成相关。与之相应,DEGs在碳代谢、碳分配及碳固定的KEGG pathways中显著富集。富集于各GO terms的DEGs通过KEGG pathways网络彼此关联并协同作用,共同影响着双亲棉纤维发育。(2)NGS-BSA技术的扩展及陆地棉LP相关QTL的定位本研究用于构建BSA测序池的F_2单株均用F_(2:3)自交系的目的性状进行校验,以确保2个DNA文库的目标区间符合理想基因型。此外,本研究提出对F_2半同胞作图群体分别进行BSA分析,并将多组分析所得QTL的重叠区间作为最终基因组候选区间。该策略可高分辨率定位与目的性状显著相关的稳定QTLs。本研究将该方案应用于EZ60/CCRI127与L177/CCRI127 2个F_2群体,并将LP相关QTL定位于D09:37,098,560 bp-41,509,122 bp,覆盖4.41 Mb。通过构建基于BSA定位区间的高密遗传图谱,候选区间可缩小至30,976 bp,增效基因来自高LP母本EZ60。(3)LP候选基因的鉴定及其造成CCRI127低衣分性状的变异解析精细定位区间内共4个基因,分别为Ghalg7、Gh PAP16、GhIQD14与Gh GNS1。根据LP功能基因群的特征表达谱,最终将GhIQD14确定为候选基因。进一步研究发现,GhIQD14~(CCRI127)存在1个编码区SNP(Coding SNP,c SNP),该SNP-39,560,387(G→T)会导致氨基酸的非同义替换。GhIQD14~(EZ60)在双亲及BSA文库中的等位基因频率与相应LP表型值显著正相关。因此,GhIQD14可能在调控陆地棉LP形成过程中发挥重要作用。(4)基于PCAMP策略的陆地棉FS相关QTL的定位PCAMP技术是将基于同一单杂交分离群体构建的梯度池(n≥3)成对分组进行BSA分析,并将多组分析所得QTL的重叠区间作为与目的表型相关的候选位点。本研究应用PCAMP技术分析了EZ60/CCRI127 F_2子代的FS变异,并将QTL区间由基于高低池BSA分析的8.14 Mb大幅缩小至基于PCAMP分析的2.47 Mb。基于该区间构建的饱和遗传图谱可将FS相关QTL进一步缩小到88,493 bp,增效基因来自高FS父本CCRI12Medidas preventivas7。(5)FS相关候选基因在双亲间的变异及其对棉纤维发育的影响候选区间内4个基因分别为NA(GH＿D09G1317)、GhCKX1、Ghgat B与Gh DNAJC7。根据RNA-seq分析中这4个基因的表达谱数据,最终将GhCKX1确定为候选基因。GhCKX1~(EZ60)的exon 1内存在2个c SNP,均会引起氨基酸的非同义替换。双亲GhCKX1等位基因按孟德尔遗传影响F_2子代的FS,且GhCKX1~(CCRI127)在L-bulk、M-bulk与H-bulk中的频率依次升高。(6)陆地棉FS候选基因GhCKX1的Alpelisib核磁功能验证GhCKX1基因在拟南芥(A.thaliana)2号染色体存在高度同源基因AT2G41510。本研究利用GhCKX1~(CCRI127)基因对野生型拟南芥进行了遗传转化。q PCR分析证实,35s驱动GhCKX1~(CCRI127)的表达提高了其m RNA在转化系中的稳态水平。显微观察结果表明,过表达系与对照主茎基部以上1cm处的木质部细胞壁平均厚度分别为1.4675μm与1.9633μm,6 cm处分别为1.2778μm与1.9126μm,11 cm处分别为0.8533μm与1.6933μm,差异显著(P<0.0001)。本研究首次报道的GhIQD14与GhCKX1基因丰富了陆地棉衣分及纤维强度的优异基因库,新开发的紧密连锁标记为陆地棉产量与品质的分子标记辅助选择及分子设计育种提供了依据。