成熟的ICI 46474细胞培养晶状体是一个无血管的透明器官。晶状体具有独特的结构,由两种细胞组成,一种是包裹于外层的晶状体上皮细胞,另一种是内部紧密排列的晶状体纤维细胞,占晶状体细胞的99%。为了建立和维持晶状体的透明度,纤维细胞内充满高浓度的晶状体蛋白,中央的纤维细胞程序性去除其中的细胞核、高尔基体、内质网、线粒体等细胞器,形成无细胞器区(OFZ)。如果晶状体纤维细胞中细胞器去除异常,OFZ形成障碍,将会导致白内障的发生。深入阐明晶状体发育分化的过程对揭示先天性白内障的发病机制具有重要意义。先天性白内障致病基因热休克转录因子4(HSF4)在晶状体中特异性表达。缺失Hsf4的小鼠、斑马鱼均出现白内障表型,晶状体中央次级纤维细胞的细胞核、线粒pathology of thalamus nuclei体、内质网等细胞器降解受到抑制。在小鼠和人的晶状体上皮细胞中,HSF4通过调节DNase 2β表达水平和DNase活性,促进晶状体纤维细胞的脱核过程。目前HSF4促进其他细胞器降解的分子机制仍不清楚。自噬是一种降解细胞器的途径。有研究表明自噬参与晶状体分化过程,自噬体转运蛋白FYCO1突变将导致先天性白内障的发生,自噬相关基因EPG5敲除小鼠也出现了先天性白内障表型。但也有研究表明晶状体终末分化不依赖自噬,ATG5是自噬泡延伸的关键蛋白,敲除Atg5的小鼠晶状体细胞器降解正常。PIK3C3或VPS34的突变不影响小鼠晶状体纤维细胞终末分化过程中细胞器的降解。目前关于自噬是否参与晶状体纤维细胞中细胞器降解仍存在争议。本课题组之前的研究表明Hsf4突变小鼠具有严重的白内障表型,晶状体纤维细胞中细胞器降解异常以及自噬降解功能异常。雷帕霉素处理Hsf4突变小鼠晶状体后可以激活自噬,也可以促进晶状体纤维细胞中细胞器的降解。缺失Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞系中自噬泡生成和融合异常。这些结果表明HSF4通过介导自噬促进晶状体纤维细胞中细胞器的降解,但具体分子机制不清楚。本文进一步确定了HSF4调控的自噬在晶状体分化中的分子机制。我们通过转录组测序筛选发现Hsf4突变小鼠晶状体中自噬核心蛋白ATG9a特异性减少。缺失Hsf4的小鼠晶状BLZ945 molecular weight体上皮细胞中ATG9a m RNA和蛋白水平显著减少。通过双荧光素酶报告实验和Ch IP实验,我们发现HSF4直接转录激活ATG9a的表达。为了确定ATG9a在晶状体分化中的作用,我们通过免疫荧光实验发现ATG9a在晶状体正在分化的纤维细胞中特异性表达,ATG9a与自噬标志物LC3以及线粒体、内质网等细胞器存在共定位。这提示ATG9a在晶状体分化过程中参与晶状体纤维细胞的自噬过程和细胞器降解。同时,不同于标准的ATG9a Fl-a转录本,我们发现ATG9a在晶状体中存在一种特殊的ATG9a转录本X3(表达蛋白ATG9a X2)。为研究二者在自噬中承担的功能,我们通过免疫荧光检测发现ATG9a Fl-a在胞质中呈弥散分布,ATG9a X2在胞质中形成大的点状荧光,并且与自噬泡出现大量的共定位。我们在敲除Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞系中回补ATG9a的两种转录本,结果表明ATG9a可以部分恢复敲除Hsf4的晶状体上皮细胞的自噬功能。与ATG9a Fl-a转录本相比,回补ATG9a X3转录本后,敲除Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞中自噬功能明显恢复。以上结果表明在小鼠晶状体分化发育过程中ATG9a X3转录本也在自噬中发挥作用。雷帕霉素处理体外培养的Hsf4突变小鼠晶状体和敲除Hsf4的晶状体上皮细胞,结果显示雷帕霉素可以部分恢复ATG9a X2蛋白水平。综上,我们的结果表明小鼠晶状体分化过程中HSF4通过转录激活ATG9a调控自噬,这对揭示HSF4调控自噬促进晶状体分化过程中细胞器降解的机制具有重要意义。