目的:探究ISL1基因启动子区序列变异对房间隔缺损(Atrial septal defect,ASD)和法洛四联症(Tetralogy of Fallot,TOF)发生发展的影响。从基因表达水平研究ASD和TOF发病的遗传分子机制,为先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)的分子诊断和药物治疗提供干预靶点。方法:1.ASD患者ISL1基因启动子变异鉴定和功能实验:(1)收集332例ASD患者和293例健康对照组的血液样本。分离外周血并提取血液样本的基因组DNA。(2)采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)对ISL1基因启动子片段扩增后直接送测序,分析ISL1基因启动子变异情况。(3)针对仅在ASD组出现的变异位点构建含有ISL1基因启动子变异位点的p GL3-basic重组质粒,将这些表达载体与SV40内参表达载体(p RL-SV40)转染到人胚胎肾细胞(Human embryonic kidney cells,HEK293)和小鼠心房肌细胞(HL-1),检测荧光素酶在两种细胞中的表达水平,统计分析ISL1基因启动子序列变异对转录活性和基因表达的影响。(4)通过电泳凝胶迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证变异对基因启动子和转录因子结合能力的影响。(5)使用JASPAR在线核心数据库(https://jaspar.genereg.net/)预测上述ISL1基因启动子携带变异后与其结合的转录因子的改变。2.TOF患者ISL1基因启动子变异鉴定和功能实验:(1)采集308例TOF患者的血液标本进行基因组DNA的提取。(2)对ISL1基因启动子片段进行PCR扩增和Sanger测序,对PCR产物测序结果与野生型ISL1基因启动子片段进行比对发现变异位点。(3)对于仅在TOF病人发现的ISL1基因启动子Z-VAD-FMK说明书变异位点,构建含有ISL1基因启动子变异位点的p GL3-basic报告基因表达载体,并转染HL-1细胞,对ISL1基因启动子区的变异位点进行功能分析。(4)通过EMSA实验进一步检测ISL1基因启动区变异对其与转录因子结合能力的影响。(5)根据JASPAR数据库,对仅在TOF患者ISL1基因启动子区发现的变异位点影响的转录因子进行预测。结果:1.ASD患者ISL1基因启动子变异鉴定和功能实验:(1)通过筛查332例ASD患者的ISL1基因启动子区,鉴定出4个仅在ASD患者中出现的变异[g.4923G>C(rs541081886),g.5079A>G(rs1371835943),g.5247A>G(rs36216897)和g.5309G>A(rs116222082)],这四个变异位点在健康对照组中均未发现,其中有一个变异位点[g.5309G>A(rs116222082)]在两个患者中出现。(2)HEK293细胞和HL-1细胞的细胞功能验证均一致显示,其中的三个变异点[g.4923G>C(rs541081886),g.5079A>G(rs1371835943),g.5309G>A(rs116222082)]显著降低了ISL1基因启动子的转录活性(P<0.05)。(3)EMSA结果显示,这三个变异显著影响了转录因子与启动子的结合能力。(4)JASPAR在线数据库预测结果显示ISselleck NMRL1基因启动子区变异会影响转录因子的结合位点。2.TOF患者ISL1基因启动子变异鉴定和功能实验:(1)通过Sanger测序对308例TOF患者进行ISL1基因启动子区变异筛查,与正常对照组比对,共发现四个仅出现在TOF患者中的ISL1基因启动子变异位点,其中有一个是新的单核苷酸变异(Single nucleotide variants,SNV)[g.4581A>G(rs1747215641),g.4630G>A(rs1264694566),g.5085G>A,g.5221C>T(rs1484364medical grade honey688)]。(2)通过双荧光素酶活性实验,其中的三个变异位点[g.4581A>G(rs1747215641),g.4630G>A(rs1264694566),g.5085G>A]显著降低了ISL1基因启动子的转录活性。(3)进一步的EMSA实验结果验证了这三个改变转录活性的变异位点同样地影响了启动子与转录因子的结合能力。(4)通过JASPAR数据库预测发现在TOF患者中鉴定的ISL1基因启动子区变异会创造、破坏新的转录因子假定结合位点。结论:在本研究中,在ASD和TOF患者中发现的ISL1基因启动子区变异位点显著改变了ISL1基因启动子的转录活性和与转录因子的结合能力,进一步影响ISL1基因的表达,最终作为致病因素参与ASD和TOF的发生,为CHD的药物治疗提供了新的干预靶点。