目的:研究川陈皮素(Nobiletin,NOB)对乌头碱诱发的室性心律失常大鼠的作用,并从电生理以及分子对接的角度探索NOB对大鼠心肌细胞上主要离子通道电流(INa、Ito、ICa-L)动力学特征的影响,阐明其抗心律失常的机制。方法:1、通过大鼠尾静脉注射乌头碱的方法建立大鼠室性心律失常模型,观察评估NOB对此模型大鼠心律失常的影响。2、采用MTT法检测NOB对于乳鼠心肌细胞的毒性,确定安全范围。3、采用Langendorff装置对离体大鼠心脏进行主动脉逆向灌流,采用胶原酶配合梯度复钙法分离耐钙稳定的单个心肌细胞。4、利用全细胞膜片钳技术研究给药前、后各离子通道电流的变化,评估NOB对各通道动力学Protein Tyrosine Kinase抑制剂特征的影响。5、使用分子对接技术,计算并预测NOB对于Nav1.5通道蛋白结构(包括失活状态)的影响,解释药物效应的结构生物学基础。结果:1.NOB对乌头碱诱发的SD大鼠心律失常的影响我们用大鼠尾静脉注射乌头碱的方法成功建立了大鼠室性心律失常模型,以不同剂量的NOB预防给药,观察药物是否具有抗室性心律失常的作用。结果表明,5、10、20mg/kg的NOB预处理能使得乌头碱诱导的室性早搏的发生时间由给药前的(6.53±0.60)min 依次地推迟为(9.57±0.59)min、(10.46±0.81)min、(11.58±0.55)min(n=10,p<0.05);室性心动过速由给药前的(7.74±0.72)min依次推迟为(18.55 ±1.25)min、(20.31±1.84)min、(21.46±1.53)min(n=10,p<0.01);致命性室颤的发生率由给药前的90%降为20%、10%、10%(n=10,p<0.01)。由此可知,NOB有抗乌头碱诱导大鼠心律失常的效果,此效果与阳性对照组(胺碘酮处理)相似。2.不同浓度的NOB对SD乳鼠心肌细胞活力的影响采用MTT法检测相关浓度梯度的NOB对原代培养的SD乳鼠心肌细胞活性的影响。结表显示:在孵化1d的乳鼠心肌细胞培养基中加入5、10、25、50、100、200 μmol/L 的 NOB,细胞活性分别降低(0.99±3.17)%,(5.43±5.38)%,(6.91±5.38)%,(9.63±3.64)%,(16.30±1.36)%(n=6,p>0.05),(17.04±3.80)%(n=6,p<0.05)。可得出环境NOB的浓度在200μmol/L以下,对于心肌细胞活力没有显著性影响。因此,后续膜片钳实验NOB的浓度可在200 μmol/L以内。3.不同浓度NOB对大鼠心室肌细胞各离子通道的影响(1)NOB对大鼠心室肌细胞电压门控钠通道的影响使用全细胞膜片钳技术引导并记录电压门控钠离子通道电流INa,通过给药前后自身对照法观察各剂量NOB下该电流的变化。结果发现:25、50、100μmol/L的NOB可使钠峰值电流由给药前的(-87.79±4.21)pA/pF分别下降为(-61.87±2.54)pA/pF、(-50.88±5.41)pA/pF、(-38.90±3.21)pA/pF(n=10,p<0.01),抑制率分别为(29.53±2.90)%、(42.04±6.16)%、(55.69±3.66)%(n=10,p<0.01),抑制作用呈明显的浓度依赖性。不同浓度的NOB均可影响INa的电流-电压(I-V)关系曲线,且随着给药浓度的提高,曲线显著上移贴近基线,而相关的曲线的变化趋势与轨迹、峰值电位基本不受影响;25、50、100 μmol/L的NOB使激活拟合曲线显著沿正坐标轴方向去极化方向移动,半数激活电压(V1/2-ac)由给药前的(-62.00±0.53)mV依次变为(-56.17±0.44)mV、(-53.77±0.29)mV和(-49.89±0.18)mV(n=7,p<0.01);25、50、100μmol/L NOB使失活动力学拟合曲线向超极化方向偏移,半数失活电压(V1/2-in)由给药前的(-75.00±0.57)mV依次变为(-79.59±0.44)mV、(-82.72±0.64)mV 和(-87.94±0.60)mV(n=7,p<0.05),斜率因子κ由给药前的(8.03±0.53)依次变为(8.55±0.56),(9.23±0.47),(9.39±0.39)(n=7,p<0.05);此外,25、50、100μmol/L的NOB可使钠通道失活后恢复曲线沿时间轴向右移动,使恢复时间τ由给药前的(21.51±0.95)ms 延长为(26.75±0.94)ms、(29.16±0.34)ms、(32.04±0.78Medical implications)ms(n=7,p<0.01)。由此可知NOB可阻滞电压门控钠通道由失活态进入静息态,提高了通道开放的阈值,延长了通道的失活状态。(2)NOB对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾通道电流(Ito)及其动力学特征的影响采用电压钳模式与相应刺激方案引导并记录各剂量NOB下Ito的变化。结果显示,10、25、50和10Oμmol/L的NOB使大鼠心室肌细胞Ito的峰值电流密度由给药前的(66.12± 5.88)pA/pF 依次降为(61.03±5.13)pA/pF、(54.60±4.92)pA/pF(n=6,p>0.05)、(52.17±2.00)pA/pF(n=6,p<0.05)、(33.18±5.99)pA/pF(n=6,p<0.01),抑制效果呈现浓度依赖性。后续实验中,50、100 μmol/L的NOB均可影响Ito的电流-电压(I-V)关系曲线,且随着给药浓度的提高,曲线显著下移贴近基线,而相关的曲线的变化趋势与轨迹、峰值电位基本不受影响;50、100μmol/L的NOB可使Ito的激活拟合曲线向电压轴正方向右移,半数激活电压(V1/2-ac)由给药前的(4.94±0.45)mV依次变为(10.61±0.63)mV、(27.64±0.67)mV(n=6,p<0.01);50、100μmol/L 的 NOB 使失活动力学拟合曲线显著左移,半数失活电压(V1/2-in)由给药前的(-25.02±1.02)mV依次降低为(-29.80±0.61)mV、(-35.47±0.54)mV(n=6,p<0.01),斜率因子κ由给药前的(4.50±0.60)依次变为(4.73 ±0.84),(5.34±0.47)(n=6,p>0.05);50、100 μmol/L 的 NOB 还可以使 Ito 失活后恢复曲线沿时间轴向右移动,使恢复时间τ由给药前的(12.75±2.81)ms延长为(16.58±6.63)ms、(25.77±2.56)ms(n=6,p<0.01)。这表明NOB可阻滞瞬时外向钾通道由失活态进入静息态,延长了通道的失活状态,提高了瞬时外向钾通道开放的难易程度。(3)NOB对大鼠心室肌细胞L-型钙通道(MRTX1133价格ICa-L)及其动力学特征的影响采用电压钳模式与相应刺激方案,记录各剂量NOB下ICa-L的变化。10、25、50、100 μmol/LNOB依次使ICa-L的峰值电流密度由给药前的(-29.76±5.41)pA/pF依次降为(-27.03± 4.87)pA/pF、(-25.53± 4.35)pA/pF、(-25.19± 3.39)pA/pF(n=6,p>0.05)、(-21.80±4.01)pA/pF(n=6,p<0.05)。即NOB对ICa-L具有抑制效果,且此效果呈现浓度依赖性。50、100μmol/L的NOB可影响ICa-L的电流-电压(I-V)关系曲线,且随曲线显著上移贴近基线,而相关的曲线的变化趋势与轨迹、峰值电位基本不受影响;50、100μmol/L NOB可使ICa-L的激活拟合曲线向电压轴正方向移动,半数激活电压(V1/2-ac)由给药前的(-31.19±2.07)mV 依次变为(-21.50 ± 2.64)mV、(-7.28±2.72)mV(n=6,p<0.01);50、1(μmol/L的NOB使失活拟合曲线向电压轴超极化方向移动,半数失活电压(V1/2-in)由给药前的(-20.90±0.80)mV 依次变为(-34.00±1.50)mV、(-47.90±1.28)mV(n=6,p<0.01),斜率因子κ由给药前的(9.27±1.14)依次变为(9.66±0.71),(10.55±1.51)(n=6,p>0.05);此外,50、100μmol/L的NOB可使ICa-L失活后恢复曲线沿时间轴向右移动,并分别使恢复时间τ由给药前的(18.86±0.85)ms延长为(33.21±2.06)ms、(42.56±3.92)ms(n=6,p<0.01)。结果表明NOB可阻滞L-型钙通道由失活态进入静息态,提高了通道开放的阈值,延长了通道的失活状态。4、NOB与Nav1.5分子对接计算的结果分子对接的结果显示,NOB与rNav1.5、rNav1.5(QQQ)与hNav1.5的结合能分别为-6.655 kcal/mol、-6.562 kcal/mol、-5.693 kcal/mol,MM-GBSA 结合能为-36.44 kcal/mol、-29.32 kcal/mol、-51.71 kcal/mol,表现出NOB与电压门控钠通道相关蛋白Nav1.5具有良好的结合潜力。蛋白-配体相互作用谱表明,NOB与1762位的苯丙氨酸残基(Phe-1762)以π-π堆积键结合,与1712位的丝氨酸以氢键结合。结论:NOB预处理具有抗乌头碱诱导的大鼠室性心律失常发生的作用,此效应与其抑制INa、Ito、ICa-L并改变其通道动力学特性相关。