研究背景:普拉德-威利综合征(PWS,Prader-Willi syndrome),俗称小胖威利综合征,是由15号染色体q11.2-q13父源性片段缺失或甲基化异常导致的罕见病,分为缺失亚型、母系单亲二倍体亚型和印记缺陷亚型,涉及的基因包括蛋白编码基因 CYFIP1、GABRA5、GABRB3、GABRG3、IMP3、MAGEL2、MKRN3、NDN、NIPA1、NIPA2、SNRPN、SNURF、TUBGCP5 和小核仁 RNA(snoRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)。主要临床表现为:三岁之前严重的肌张力低下及因此导致的吮吸反射差、神经发育迟缓、喂养障碍;三岁之后的行为障碍尤其是贪吃及与此相关的病态肥胖、发育迟缓、性腺发育障碍、甲状腺功能降低、特殊面容等。但是,PWS的确诊依赖于甲基化特异性多重连接Photorhabdus asymbiotica探针扩增(MS-MLPA)技术,为基层医院的诊断带来困难。目前PWS的治疗主要为应用生长激素和对症治疗,但是尚无根本的治疗措施,因此,还需对PWS进行深入研究。尽管目前关于PWS的研究主要集中在神经系统、内分泌系统以及肥胖等,血液系统是否受到影响尚未有研究。红细胞作为人体中最丰富的细胞,除运送氧气外,其代谢产物例如NO、膜脂成分等的异常也参与肥胖、神经系统疾病等的发生发展;红细胞还参与了心脑血管疾病的发生。因此,探究PWS中红细胞是否改变以及改变的机制将有利于深入了解PWS。目的:1.观察不同年龄阶段PWS的红细胞质量是否有改变;2.探究PWS中红细胞异常是由哪部分细胞结构改变导致的;3.探究PWS中的红细胞异常是由病态肥胖、激素异常导致的继发性改变还是由基因缺陷直接造成的;4.构建PWS的基因文库,利用细胞模型筛选造成红细胞异常的靶基因及机制;5.寻找辅助诊断PWS的简易指标。研究方法(技术路线见附图1):1.纳入研究对象:收集2019年——2021年就诊于山东省立医院的PWS患者和健康对照以及肥胖对照作为研究对象,记录年龄、性别、身高、体重和诊疗信息,对PWS患者进行MS-MLPA检测,同时所有研究对象均进行甲功、生长激素、血糖、血脂、肝功等在PWS中异常指标的检测,纳入研究的所有样本均使用同一型号的机器进行检测。所有研究对象均经过纳入排除标准筛选,并已签署知情同意书。2.研究分组:将符合纳入排除标准的研究对象按照年龄分为大于等于三岁组和小于三岁组,对各个年龄组的研究对象分别进行研究。其中,纳入的PWS患者均经过基因检测并且分为初发患者和接受治疗的患者,其中接受治疗的患者治疗方案为对症治疗大于三个月并且治疗后甲功和生长激素都维持在正常范围内,初发患者为未接受过治疗的患者。各组研究对象年龄分布符合正态分布。(1)接受治疗的PWS患者分组:在大于等于三岁组中,由于PWS患者(n=16)存在病态肥胖,对照组分为健康对照组(n=16)和单纯肥胖对照组(n=16)两组;小于三岁组分为PWS患者组(n=10)和对照组(n=16);(2)初发患者组(n=5)。3.利用非配对t检验分析血常规、血涂片和红细胞渗透脆性观察红细胞的质量变化。4.利用Spearman相关性分析绘制基因型、血常规指标、血清EPO、Fe、溶血指标、肥胖、甲状腺激素、生长激素的相关性热图,筛选可用于区分患者和对照的简易指标并进一步利用接受者操作特性曲线(ROC曲线)验证。5.观察红细胞结构的改变:(1)血红蛋白:利用结晶紫染色和电镜观察PWS红细胞血红蛋白是否形成包涵体,利用高效液相色谱(HPLC)观察珠蛋白链比例;(2)膜骨架:检测膜骨架蛋白的变化;(3)膜脂:利用靶向脂质组学检测红细胞膜脂质组成的改变。6.利用非Tamoxifen临床试验配对t检验比较红细胞在PWS患者不同年龄组、治疗组与初发组、不同BMI组、基因亚型组间的改变,以进一步筛选造成红细胞改变的原因。7.利用CRISPR-Cas9技术或shRNA分别构建PWS缺失片段的基因文库,构建基因敲除或敲低的细胞模型。8.观察细胞模型的形态、膜骨架的改变,从增殖、分化、氧化应激的角度寻找原因,并利用单克隆筛选靶标基因。结果:1.大于等于三岁组的研究对象基线情况大于等于三岁组研究对象基线情况与以往文献报道相符,即与健康对照相比,PWS患者出现显著肥胖,但是与肥胖对照无显著差异;对症治疗后的PWS患者甲状腺激素和生长激素与健康对照和肥胖对照相比无明显差异。2.PWS患者存在缺铁性小细胞贫血和形态异常在大于等于三岁组中,与健康对照和肥胖对照相比,虽然PWS患者的红细胞计数(RBC)无明显改变,但是血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)显著降低,与这一发现相符的是,在PWS组血清铁水平下降,促红细胞生成素(EPO)水平高于健康对照组,提示PWS患者存在与轻度缺铁相关的小细胞贫血。在大于等于三岁组中,与健康对照和肥胖对照相比,PWS患者红细胞分布宽度(RDW)增加,同时血涂片的瑞氏吉姆萨染色提示畸形红细胞和红细胞碎片增加。与以上发现吻合的是,红细胞渗透脆性升高,血清heme升高、但总胆红素(Tbil)和间接胆红素(Ibil)无明显差异,提示PWS患者红细胞在渗透压力下更易发生溶血,体内的溶血状况并不严LXH254核磁重。以上结果提示PWS患者红细胞不稳定性增加。小于三岁组中同样存在小细胞贫血和红细胞形态异常。3.RDW/HCT在PWS组显著升高血常规指标RDW/HCT在PWS组高于对照组,相关性矩阵和接受者操作特性曲线(ROC曲线)提示RDW/HCT可以有效区分PWS组和对照组。4.PWS患者红细胞存在膜骨架组装障碍和膜脂质异常,胎儿型血红蛋白轻度增加PWS患者的血涂片结晶紫染色没有观察到包涵体,电镜提示红细胞内部结构均匀,HPLC检测提示红细胞的α和β珠蛋白肽链比例正常,但是胎儿型血红蛋白(HbF)比例轻微增加。蛋白考马斯亮蓝染色和Western Blot的结果提示来自PWS患者的部分红细胞骨架蛋白减少。由于肌动蛋白的动态平衡在膜骨架稳态中发挥重要作用,检测发现在PWS患者的红细胞中,F-Actin与G-Actin的比值下降,提示PWS患者红细胞肌动蛋白组装障碍可能是造成膜骨架组装障碍的原因。由于膜脂质和膜骨架紧密连接,对红细胞膜的靶向脂质组学的OPLS-DA分析显示,PWS患者与健康对照和肥胖对照区分明显,其中变化最显著的是多不饱和脂肪酸等与膜流动性相关的脂质减少。5.PWS患者红细胞的改变与肥胖、年龄和亚型无关,但是治疗可以改善红细胞骨架缺失的表型以及膜脂质不同BMI分组之间、不同年龄分组之间以及不同亚型之间,红细胞稳定性、膜骨架蛋白和膜脂质无差异。但是,初诊患者治疗前后的红细胞膜骨架蛋白部分改善,此外,未治疗的患者膜脂质组成与治疗后的患者区分明显。但是,即使患者通过治疗激素恢复正常,依然与对照组有明显区别。6.基因缺失是引起红细胞异常的原因利用PWS基因文库构建的红系细胞模型显示基因敲除或者敲低导致细胞异常形态的比例增加,细胞内部氧化应激增强,但是不影响红细胞的增殖或分化过程。结论:我们的研究揭示了 PWS患者存在与缺铁相关联的轻微小细胞贫血以及红细胞畸形和溶血倾向,这种改变与由F-Actin组装障碍导致的红细胞膜骨架蛋白组装障碍以及膜脂质改变相关。基因缺陷导致的氧化应激增加可能是其机制。RDW/HCT在PWS患者中明显升高,可以作为辅助诊断指标。