H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 highly pathogenic avian influenza virus,H5 HPAIV)在禽类中的传染性和致病性极强,必须在BSL-3实验室中操作,因此实验环境一直是研究的一个瓶颈。本研究制备19株H5 HPAIV的假病毒,构建H5 HPAIV假病毒库;利用假病毒模型获得高血凝效价的重组病毒,为在BSL-2实验环境下进行流感病毒的研究、疫苗的制备、疫苗评价和药物筛选提供一种便捷的方法。本研究利用PEI转染、磷酸钙转染、脂质体转染三种转染方法制备流感假病毒,比较转染效率后选择磷酸钙转染法制备假病毒;将4株H5 HPAIV的HA或NA基因片段插入pCMV/R载体,获得3个HA和4个NA重组质粒,两两随机组合后的HA、NA质粒与p CMV/RΔ8.9质粒、p HR-CMV-Luc质粒构成4质粒系统,利用磷酸钙法将4个质粒转染至HEK293T细胞获得12株假病毒,血凝实验检测发现假病毒的血凝效价在100～400HAU/m L之间、Western blot检测发现在75 k D、54 k D、50 k D和25 k D有特异性条带、荧光素酶试剂检测发现假病毒的相对荧光素酶活性(RLA)在50～4.5×10~5之间,表明不同H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和RLA造成影响;从WHO推荐的H5 HPAIV候选疫苗株中筛选出0到9分枝中的19株代表性病毒株,利用其HA核苷酸序NSC 119875浓度列构建进化树,利用磷酸钙转染法制备对应的假病毒,检测后发现19株假病毒粒子血凝效价与p24蛋白含量的比值都是正常的,但是部分假病毒的血凝效价及RLA偏低;从中选择高RLA的A/Thailand(KAN-1)/2004(TH)株和低RLA的A/blackbird/Hunan/1/2004(HN)株,互换两者的HA和NA质粒制备嵌合假病毒,发现TH嵌合假病毒的RLA仍然高于HN嵌合假病毒的RLA;比较TH株和HN株HA的氨基酸序列,发现共17处氨基酸有差异,再分别以两株病毒的HA蛋白作为骨架蛋白突变这17个氨基酸,比较突变假病毒的功能性,确定42、44和53是关键性位点;为确定三个位点是否会提高重组病毒血凝效价Z-IETD-FMK浓度,通过反向遗传学的方法拯救HN突变重组病毒和HN重组病毒,经细胞和鸡胚扩增后发现HN突变重host genetics组病毒的血凝效价高于HN重组病毒;利用HN突变重组病毒灭活疫苗和HN重组病毒灭活疫苗免疫小鼠获得抗血清,假病毒中和实验(Pseudovirus neutralization,PN)检测免疫血清中和效价,发现HN重组疫苗免疫血清和HN突变重组疫苗免疫血清中和效价无差异。综上所述,本研究构建了H5 HPAIV假病毒库,并利用假病毒模型在不改变重组病毒灭活疫苗免疫原性的基础上提高重组病毒的血凝效价,为后续H5 HPAIV疫苗及药物的研发提供了一种便捷的方法。