【研究背景】睡眠相关过度运动性癫痫(sleep-related hypMRTX1133ermotor epilepsy,SHE)是一种特发于非快速眼动(non-rapid eyes movement,NREM)睡眠期,以“过度运动”为主要临床表现的局灶性癫痫综合症。SHE发作间期及发作期脑电图阳性率低,其诊断主要依赖于可靠的病史及典型的临床表现,误诊或漏诊率高。因此,提高对SHE的认识,对其进行早期诊断、及时治疗具有重要的临床意义。临床研究提示SHE患者的预后与病因密切相关,探索其病理机制可为精准治疗提供线索。遗传因素作为SHE的主要病因,随着基因测序技术的发展及应用,鉴定SHE致病基因成为了解其发病机制的主要切入点。然而,目前发现的致病基因(以烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因为主)只能解释少部分患者的病因,并且部分基因的致病机制尚不清楚,也未能解释SHE为何易发于睡眠中。因此,亟需筛查及鉴定新的SHE致病基因,探索其致病机制,为深入了解SHE的发病机制及阐明与睡眠的关系提供新思路。【研究目的】1.筛查及鉴定SHE的新致病基因。2.在细胞水平和动物水平探索SHE新致病基因的功能及其相关机制。3.探索SHE为何特发于NREM睡眠期。【研究方法】1.本研究纳入2015年至2019年在西京医院神经内科综合癫痫中心就诊的SHE患者,完整采集每名患者的临床资料及静脉血标本。对收集到的SHE患者进行全外显子组测序(whole exome sequencing,WES),筛查候选致病基因。对鉴定到的SHE新致病基因,利用基于核心家系的WES(trio-based WES)方法,根据遗传模式及疾病表型进一步确认其致病性并且排除其它可能的致病基因。对可疑的致病基因位点根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南进行评级,并利用Sanger测序验证以及在家系中行共分离分析。2.分别构建表达野生型及突变型质粒的HEK293T细胞系及原代神经元,利用全细胞膜片钳、western blot、流式细胞学及免疫荧光等方法研究突变在体外细胞水平的功能及其相关机制。3.利用CRISPR/Cas9技术构建突变敲入小鼠,合笼交配后利用PCR技术进行基因型鉴定。观察分析野生鼠和突变鼠的出生情况及大体形态,利用尼氏染色观察突变对神经解剖结构的影响,并利用长程视频脑电监测评估模型鼠的表型及脑功能变化。分别给野生鼠和突变鼠腹腔注射50mg/kg戊四唑(PTZ,GABA_AR拮抗剂),评估癫痫发作阈值。4.利用在体多通道电生理技术观察分析野生鼠和突变鼠在睡眠-觉醒时期运动丘脑核团(motor thalamic nuclei,Mo TN)和次级运动皮层(secondary motor cortex,M2)局部场电位(local field potential,LFP)的变化及其同步化程度,再利用实时荧光定量PCR(q PCR)、western blot、免疫荧光等实验分析其潜在的分子机制。【研究结果】1.基因检测结果。本研究共纳入58例SHE患者。经WES检测后共发现6例患者携带6个候选致病基因突变(6/58,10.3%)。这6个突变位于4个基因(CHRNA4/B2,DEPDC5和GNeuroscience EquipmentABRG2),其中有3个突变位于GABRG2基因(NM＿198904.2:c.269C>T,p.T90M;NM＿198904.2:c.950C>A,p.T317N和NM＿198903.2:c.649C>T,p.Q217X)。经查阅文献,发现尚无该基因与SHE发病的报道。通过trio-based WES分析,进一步提示该基因可能是SHE的新致病基因。经过Sanger测序验证发现,T90M突变和Q217X突变属于遗传性突变,T317N突变属于新发突变。其中,T90M患者的母亲是该突变的嵌合体(嵌合比例为14%)。GABRG2基因编码γ-氨基丁酸A型受体(γ-amino butyric acid A receptor,GABA_AR)的γ_2亚基,T90和Q217位于该亚基的N末端,T317位于第二跨膜区域。有害性预测软件分析发现这三个突变均有很大概率影响蛋白质的结构和功能。2.离体细胞实验结果。(1)全细胞膜片钳实验发现T90M和T317N突变导致受体通道峰电流下降,而Q217X突变对受体通道峰电流无明显影响。T90M突变导致受体对Zn~(2+)抑制作用的敏感性增强。T317N突变导致受体通道电流的脱敏程度降低及失活时间常数增大。(2)Western blot、流式细胞学结果显示T90M突变导致部分γ_2亚基成熟障碍,滞留在细胞内质网中,进而使得γ_2亚基在细胞膜上的表达下降;(3)免疫荧光及共聚焦结果显示T90M和Q217X突变导致γ_2亚基在原代神经元突触分布降低。3.动物模型实验结果。由于T317N突变是三个突变中唯一的新发突变,并且携带该突变的患者临床表型比较严重,因此本研究选择T317N突变构建突变敲入小鼠(Gabrg2~(T317N/wt)鼠)。通过评估Gabrg2~(T317N/wt)鼠的表型发现:(1)Gabrg2~(T317N/wt)鼠的大体形态及神经解剖结构无明显异常;(2)Gabrg2~(T317N/wt)鼠有自发性癫痫发生,发生率约为20%,并且约75%的发作出现在睡眠中;(3)给于PTZ后Gabrg2~(T317N/wt)鼠的癫痫发生率、严重程度及致死率均高于野生鼠;(4)相较于野生鼠,Gabrg2~(T317N/wt)鼠在NREM睡眠期间的短暂觉醒事件次数增多,提示T317N突变导致小鼠睡眠片段化。4.SHE发作与睡眠相关机制。在体多通道selleckchem AZD6738电生理监测发现,在睡眠时期,相较于野生鼠,Gabrg2~(T317N/wt)鼠Mo TN和M2区域的LFP在δ频段(1-4 Hz)的功率谱密度值、相干性及同步性均显著增强。QPCR、免疫组化及western blot等实验发现,Gabrg2~(T317N/wt)小鼠各个脑区(皮层、丘脑、海马和小脑)的GABA_AR亚基m RNA及总蛋白的表达水平与野生鼠相比无明显差异;相较于野生鼠,Gabrg2~(T317N/wt)鼠不论在睡眠期还是清醒期,其各个脑区的γ_2亚基在细胞膜上的表达量均显著降低,且在睡眠时期,Gabrg2~(T317N/wt)鼠皮层和丘脑区域的γ_2亚基在细胞膜上的表达量下降程度更高。【研究结论】1.本研究首次发现GABRG2基因可能是SHE的新致病基因,扩展了SHE的致病基因谱以及GABRG2基因的表型谱。2.GABRG2基因突变(T90M、Q217X和T317N)通过影响受体上膜、分布及通道动力学参数等不同机制导致GABA_AR功能受损。3.Gabrg2~(T317N/wt)鼠模拟了SHE患者的部分表型,可作为研究SHE发病机制的新动物模型。4.Gabrg2~(T317N/wt)鼠丘脑皮质环路同步化放电病理性增强可能是SHE特发于睡眠中的潜在机制。