胆固醇作为生物必需的营养物质,在细胞分化、胚胎发育、免疫反应及神经信号传递等方面发挥着重要作用。在晚期内体的低pH环境中,脂蛋白将结合的胆固醇释放出来,经过NPC2蛋白的传递,最后通过NPC1蛋白的跨膜运输将胆固醇转运到细胞质中而发挥特定的生物学功能。当NPC蛋白发生突变后,会导致人类患尼曼匹克病,并在其细胞内异常累积胆固醇。NPC蛋白及胆固醇不仅在细胞生命活动中扮演着重要的角色,还被许多病毒所利用来感染宿主细胞。包括埃博拉病毒、甲肝病毒在内的多种高致病性包膜病毒以NPC1蛋白为胞内受体,通过其介导的膜融合过程,将遗传物质释放到细胞质中。非洲猪瘟病毒的感染不仅依赖于NPC1蛋白,还需要NPC2蛋白的帮助。胆固醇更是参与到病毒感染周期的各个阶段。可能正是因为NPC蛋白及胆固醇在细胞生理活动中的重要性,以及胞内胆固醇转运通路在生物体内相对比较保守,才被多种病毒所劫持。19世纪中期,人们在感染的家蚕中鉴定到了杆状病毒,与其他病毒不同的是,杆状病毒的病毒粒子形态有两种:一种为包埋型的病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV),在病毒的口服感染过程中,ODV的多角体外壳在节肢动物肠道碱性环境中被溶解,成为具有感染能力的病毒并感染肠道细胞;另一种为出芽型的病毒粒子(budded virus,BV),引发细胞与细胞之间的系统感染,通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞。此外,杆状病毒在药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域发挥着重要作用。然而,杆状病毒从发现至今已有一百多年,但是其感染细胞的受体、感染机制等尚不明确。已有研究发现BmNPC1蛋白在BmNPV(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)进入细胞的过程中发挥了重要作用,并且与BmNPV包膜糖蛋白GP64互作。家蚕NPC2家族蛋白成员BmPP(Bombyx mori promoting protein),促进BmNPV感染家蚕细胞,并且具有结合胆固醇的能力。此外还有报道称细胞的胆固醇等分子参与杆状病毒粘附细胞的过程。但是BmNPC蛋白及胆固醇在介导BmNPV感染中扮演什么角色、具有什么机制仍然是个迷。有鉴于此,本研究首先探究了 BmNPC1蛋白的定位及其在杆状病毒进入宿主细胞过程中所扮演的角色,并在BmNPV非纳受细胞系Sf9细胞中表达BmNPC1后添加病毒观察感染情况,验证其是否为BmNPV感染宿主细胞的胞内受体。进一步通过敲除BmNPC2细胞系研究了 BmNPC2蛋白影响病毒感染的时期,并通过添加纯化的BmNPC2蛋白进行功能验证。通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验明确BmNPC2蛋白与BmNPC1、GP64蛋白的互作关系并解析了 BmNPC蛋白是如何协同介导BmNPV感染的分子机制。最后通过Lov及MβCD药物处理PCI-32765分子量降低了细胞胆固醇浓度,分析了胆固醇在杆状病毒感染过程中的作用。主要研究结果如下:1.家蚕NPC1蛋白介导杆状病毒进入细胞的分子机制本研究首先利用细胞膜以及晚期内体标志物探究了 BmNPC1蛋白在家蚕BmE细胞中的定位情况,发现BmNPC1蛋白的亚细胞定位与人NPC1蛋白的定位有差异,BmNPC1蛋白不仅定位于晚期内体膜,还定位于细胞膜上。利用敲除BmNPC1细胞系探究病毒前期感染情况,结果表明BmNPC1的缺失并不影响病毒对BmE细胞的结合。病毒感染BmE细胞2小时后,BmNPV通过膜融合将杆粒大量释放到细胞质中并通过核孔进入细胞核,但在敲除BmNPC1细胞中,BmNPV进入细胞核的过程受到明显抑制,其核定位率仅为对照BmE细胞的1/8。这些结果表明BmNPC1蛋selleck产品白可能在BmNPV芽生病毒粒子膜融合过程中发挥重要作用。将DiO染料包裹的重组BmNPV-EGFP添加到BmNPC1敲除细胞中,结果发现病毒膜融合过程被显著抑制。纯化BmNPC1-C区蛋白后,将其与BmNPV-EGFP孵育后添加到BmE细胞,发现病毒感染量只有对照组的20%,说明BmNPC1蛋白通过其胞外区C区与病毒相互作用介导了病毒包膜的融合。为了探究BmNPC1是否是BmNPV感染细胞的细胞内受体,进一步在BmNPV非纳受细胞系Sf9中表达了BmNPC1,当BmNPV感染后,打破了 BmNPV在Sf9细胞中的膜融合屏障,释放出杆粒并通过核孔进入到Sf9细胞的细胞核,但BmNPV在Sf9细胞中无法进行复制。2.家蚕NPC2蛋白促进杆状病毒感染的机制在BmE细胞中使用CRISPR/Cas9系统成功敲除BmNPC2后,利用Filipin染料对细胞脂类进行染色,发现敲除BmNPC2后胆固醇在细胞内异常累积,进一步明确了家蚕NPC2蛋白转运胆固醇的功能。在BmNPC2敲除细胞系中添加重组的BmNPV-VP39-EGFP荧光病毒,结果表明敲除BmNPC2不影响病毒的结合,但影响病毒入核的效率。进一步研究发现,敲除BmNPC2后影响了病毒膜融合的效率进而影响入核。通过杆状病毒表达系统表达并纯化BmNPC2蛋白,将其添加到BmE细胞中可以促进病毒的感染,并且可以显著提升BmNPV膜融合的效率,进一步证实了之前的结论。当BmNPC2蛋白添加到BmNPC1敲除细胞中,却不能促进病毒的感染,说明BmNPC2促进BmNPV感染依赖于BmNPC1蛋白。在细胞内共表达BmNPC2与BmNPC1-C蛋白,BmNPC2与GP64蛋白,然后进行免疫共沉淀,发现BmNPC2蛋白能够与BmNPC1-C、GP64蛋白互作,通过酵母双杂交实验也得到同样的结果。当用BmNPC2蛋白结合从BmNPC2敲除细胞中获得的子代病毒粒子后,可以促进子代病毒的感染能力。ELISA实验结果表明添加BmNPC2蛋白并不能增强BmNPC1-C蛋白与GP64蛋白的互作强度,但是低pH处理可以增强BmNPC1-C蛋白与BmNPC2以及BmNPC1-C与GP64蛋白的互作强度,说明BmNPC2蛋白可能是通过增强BmNPC1-C蛋白与GP64蛋白的互作效率从而促进膜融合过程的。3.胆固醇在杆状病毒感染中的作用与功能在BmE细胞中添加能竞争性抑制胆固醇合成过程中的限infectious organisms速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶的药物Lovastatin(Lov)、去除细胞膜胆固醇的药物MβCD或外源胆固醇来降低或升高细胞胆固醇浓度,探究胆固醇在BmNPV感染中所扮演的角色。在BmE细胞内添加Lov三天后,细胞内胆固醇浓度降为对照组的60%,并且显著抑制了病毒感染,其病毒载量只有对照组中的1/4。使用Lov和MβCD去除细胞膜胆固醇后,病毒与细胞的结合量显著降低,只有对照组的50%。进一步研究发现,降低细胞内胆固醇浓度影响病毒膜融合的效率,进而导致病毒入核量降低,当回补外源胆固醇后,病毒结合量及入核量均得到恢复。Lov处理BmE细胞后,在病毒感染20小时后检测其对病毒蛋白表达的影响,结果表明细胞内胆固醇浓度降低对病毒蛋白的表达无影响。进一步探究降低细胞内胆固醇浓度后对病毒出芽的影响,纯化正常细胞及Lov处理细胞中的子代病毒粒子进行Western blotting分析,结果发现Lov处理后病毒出芽量与对照组相比显著降低。通过IFA实验观察病毒出芽过程中GP64蛋白与细胞脂筏的共定位情况,结果表明Lov处理抑制了细胞膜脂筏的形成,进而导致病毒出芽量降低。综上研究结果表明,BmNPV感染细胞的膜融合受体可能是BmNPC1,其介导病毒的膜融合过程,BmNPC1的表达可以在BmNPV非纳受的Sf9细胞中打破膜融合障碍。BmNPC2蛋白促进BmNPV感染的作用是通过BmNPC2-BmNPC1细胞内胆固醇转运通路而实现的,其与BmNPC1蛋白协同介导BmNPV感染,在这条通路中,BmNPC1蛋白扮演着更重要的角色。而胆固醇影响病毒与细胞膜的结合、膜融合、病毒出芽过程。本论文的研究结果进一步加深了对杆状病毒感染机制的理解,为包膜病毒劫持胆固醇转运通路感染宿主细胞提供了新的证据,同时针对重要宿主因子和病毒互作方面的深入研究,对培育BmNPV抗性家蚕素材提供新的思路。