背景和目的:ADH5(alcohol dehydrogenase 5)是乙醇脱氢酶家族的成员之一,它的主要功能是降解细胞内的S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)和S-羟甲基谷胱甘肽(S-hydroxymethylglutathione,HMGSH)。通过代谢 GSNO-活性一氧化氮和谷胱甘肽形成的化合物,ADH5可以间接调控蛋白质的亚硝化修饰,所以ADH5 又名亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)。通过代谢HMGSH-甲醛和谷胱甘肽形成的加合物,ADH5可以降解甲醛以减少其造成的DNA损伤。ADH5在细胞内具有促进线粒体自噬和抗氧化的功能。研究发现缺失ADH5的小鼠更易受致癌物的诱导发生肝癌,展示了 ADH5的抗肿瘤功能,而在非小细胞肺癌中ADH5发挥何种功能尚未明确。因此,本课题旨在研究ADH5在非小细胞肺癌中的具体功能及可能的机制。方法:1、通过TCGA数据库、GEPIA数据库以及Kaplan-Meier分析观察ADH5在非小细胞肺癌中的表达情况以及和预后的关系,收取非小细胞肺癌临床组织样品、实验室培养肺癌细胞系,对组织样品和细胞样品进行RNA和蛋白提取,进行qRT-PCR和Western blot实验从两个水平检测ADH5在非小细胞肺癌中的表达水平。2、使用ADH5过表达质粒和shRNA构建非小细胞肺癌细胞系H358及PC9过表达和敲低ADH5的稳定细胞系,进行CCK8、克隆形成及Transwell实验,观察ADH5的过表达和敲低对非小细胞肺癌的生长、转移及侵袭的影响。通过裸鼠成瘤实验检测过表达ADH5对皮下肿瘤的大小和重量的影响,对肿瘤组织进行免疫组化染色检测肿瘤增殖指标Ki67的表达情况。3、通过GEPIA数据库分析ADH5和肿瘤可塑性调控蛋白SOX2、SOX9的关系。通过Western blot实验检测稳定细胞系中SOX9的蛋白水平。使用TGF-β1处理ADH5过表达细胞系,观察TGF-β1对过表达ADH5细胞的形态的影响,Western blot实验检测过表达及敲低细胞系中Smad2/3、EMT和AKT信号通路。对过表达及敲低ADH5的细胞系使用自噬抑制剂CQ后进行Western blot实验和免疫荧光实验检测LC3和P62的变化,通过qRT-PCR实验检测线粒体动力学相关蛋白的变化。结果:1、数据库显示ADH5在非小细胞肺癌中表达下降与预后不良相关。qRT-PCR与Western blot实验显示,与正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,非小细胞肺癌细胞H1299的ADH5mRNA和蛋白水平增加,H1975的ADH5mRNA水平增加,A549、HCC827、H358、PC9、H460 的 ADH5mRNA 水平下降,A549、HCC827、H358、PC9、H1975、H460的ADH5蛋白水平下降;与癌旁组织相比,非小细胞肺癌组织中ADH5的mRNA和蛋白水平均下降。2、qRT-PCR和Western blot实验结果显示,与Vector组相比,过表达组ADH5的RNA及蛋白水平明显升高,与shControl组相比,敲低组ADH5的RNA及蛋白水平下降。CCKSTM2457 MW8及克隆形成实验结果显示,与Vector组相比,过表达组细胞生长速度下降,细胞克隆团数目减少;与shControl组相比,敲低组细胞生长速度增加,细胞克隆团数目增加。Transwell实验发现,与Vector组相比,过表达组迁移及侵袭能力增加;与shPF-02341066Control组相比,敲低组迁移及侵袭能力下降。裸鼠成瘤实验结果发现,与Vector组相比,过表达组的皮下肿瘤体积和重量均下降,对皮下肿瘤进行免疫组化实验,结果显示,与Vector组相比过表达组的肿瘤Ki67表达水平下降。3、GEPIA数据库显示ADH5与SOX2无明显相关,与SOX9正相关。Western blot实验发现过表达组中SOX9表达增加而敲低组中SOX9表达下降。使用TGF-β1处理ADH5过表达细胞系48h,发现Vector组细胞形态明显变化而过表达组不受影响;Western blot结果显示与Vector组相比,过表达组细胞的磷酸化Smad2/3水平明显增加,与shControl组相比,敲低组细胞的磷酸化Smad2/3水平明显下降;与Vector组相比过表达组的N-Cadherin、Snail以及磷酸化AKT的蛋白水平增加而E-Cadherin表达减少,与shControl组相比,敲低组细胞的N-Cadherin、Snail以及磷酸化AKT的蛋白水平下降而E-Cadherin表达增加。使用CQ后,与Vector组相比,过表达组的LC3 Ⅱ/Ⅰ和P62的水平增加,与shControl组相比,敲低组的LC3 Ⅱ/Ⅰ和P62的水平下降;免疫荧光实验显示,使用CQ后,与Vector组相比,过表达组的LC3的水平增加;qRT-PCR实验发现线粒动力学相关蛋白DRP1在ADH5过表达组中RNA水平增加,OPA1在敲低组中RNA水平增加。结论:1periodontal infection、ADH5在非小细胞肺癌中的蛋白水平和RNA水平均下降。2、ADH5在非小细胞肺癌中发挥抑制增殖和促进迁移的作用,与肿瘤细胞的可塑性相关。3、ADH5可能通过Smad2/3信号通路和自噬介导非小细胞肺癌的可塑性。