在人的一生中,人造血干/祖细胞(human hematopoietic stem and progenitor cells,hHSPCs)具有多谱系分化与长期再生的潜能,对各种成熟血细胞的持续产生与维持至关重要。对小鼠和斑马鱼的研究证实,造血干/祖细胞最初出现于主动脉背腹侧的主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区域中的造血内皮细胞(hemogenic endothelium cells,HECs),通过内皮细胞向造血细胞转化(endothelial to hematopoietic transition,EHT)产生。但是目前我们对人EHT过程的研究与认识还稍显匮乏,对人EHT与造血内皮细胞谱系决定之间的具体机制尚不明确,在一定程度上限制了 hHSPCs在再生医学领域的应用。造血发育是一个由复杂的转录因子网络调控的渐进过程,独立生长因子(Growth factorindependent-1,GFI1)是其中一个重要的转录调控因子,在多系血细胞发育中发挥重要作用,也是小鼠EHT的关键调控因子。但是有关GFI1在人的造血发育与hHSPCs的形成中的作用报道较少,GFI1是否在人EHT中发挥着与在小鼠中同样重要的作用还不得而知。人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)具有强大的自我更新能力和全谱系分化潜能,被广泛的应用于人体各系统组织细胞发育研究和再生医学研究。因此,本文利用hESCs作为模型,在体外研究人类早期造血发育过程中的调控机制。首先,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建三株GFI1敲除人胚胎干细胞细胞系H1-GFI1-/–1/2/3#,并将其进行体外单层造血分化,使其分化为造血干/祖细胞。我们通过该模型探索GFI1在人造血分化中对HSPCs的生成的影响,并通过降低人外周血中hHSPCs的GFI1基因表达,来探究其对hHSPCs功能的影响;接下来,我们在人造血内皮报告细胞系H1-GATA2WT/GFP(在造血内皮标志基因GATA2后插入表达绿色荧光蛋白GFP的人胚胎干细胞系)中敲除GFI1,构建细胞系H1-GATA2WT/GFP-GFI1-/-,进一步研究GFI1对造血发育关键细胞—HECs的作用;最后,为了进一步探究GFI1在EHT中Analytical Equipment的调控机制,我们将GFI1敲除的HECs与野生型HECs进行了转录组测序、染色质开放性测序ATAC-seq 以及蛋白质-DNA 互作检测(Cleavage Under Targets and TagmeRP56976体外ntation,CUT&Tag)分析。通过上述研究,结果显示:1.与野生型对照组相比,H1-GFI1-/-在造血分化过程中无法产生造血祖细胞及各谱系血细胞,但可产生正常的内皮细胞,表明GFI1缺失会造成人血液发育过程中内皮向造血转化功能的障碍;人外周血hHSPCs实验表明GFI1具有维持人外周血hHSPC的正常功能的作用。2.H1-GATA2WT/GFP-GFI1-/-经过造血分化后,可以产生HECs,但是分选出的HECs不再具有产生造血祖细胞的能力。在GFI1敲除细胞系造血分化过程中回补GFI1表达,则可重新产生造血祖细胞。结果提示GFI1不影响造血内皮的谱系发育,但是对EHT过程是必不可少的。3.转录组测序结果提示GFI1敲除的HECs的内皮相关基因表达上调,造血相关基因表达下调。ATAC-seq结果显示GFI1敲除显著降低HECs中血细胞发育相关基因的染色质开放程度。此结果提示在EHT发生之前,内皮细胞已在染色质基因开放性上产生了分化倾向性,开始形成独特的基因表达模式。通过CUT&Tag分析,我们进一步发现EHT过程中,GFI1的直接调控靶点—PI3CP-690550分子式K-Akt信号通路。上述生物信息学分析结果提示GFI1可通过直接结合PI3K-Akt信号通路和维持特定染色质开放这两种方式来调节人内皮细胞向造血细胞的转化,继而控制hHSPCs产生。我们在体外造血分化模型中利用广谱PI3K通路抑制剂—LY294002抑制该信号通路,导致造血干/祖细胞产生受阻,提示PI3K-Akt信号通路对EHT过程具有调控作用。综上所述,上述工作表明GFI1在人EHT过程中具有重要作用,并揭示了其在该过程中的分子机制,明确了维持正常EHT所需的表观遗传调控机制的重要性。我们的工作有助于全面了解EHT背后的分子机制,从而有助于在体外获得更多的造血干/祖细胞,为其在再生医学领域的应用奠定基础。