抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为全球范围内严重的生态问题,寻找有效的抗生素替代品迫在眉睫。乳铁蛋白肽(LFcinB,FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF)是由牛乳铁蛋白(Bovine Lactoferrin,BLF)经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的两亲性阳离子短肽,具有杀菌快速、不易产生抗药性、热稳定性及水溶性好等优点。本文以LFcinB为模板,以提高抗菌肽活性及稳定性为目标,借助生物信息学工具,以提高其电荷量、疏水性为原则,设计出新型高抗菌活性的衍生肽LFcinB-L1(LFcinB-L1,WKWRR WQWRW KLXH254体外KLGA PSITC VRRAF)。利用毕赤酵母GS115分泌性表达衍生肽LFcinB-L1,对发酵液进行LY294002分离纯化后检测衍生肽LFcinB-L1的体内外抑菌活性,并初步探究其抑菌机制。本课题主要研究内容和结果如下:(1)本文引入色氨酸(Trp)对LFcinB不同位点的氨基酸进行替换得到了5条衍生肽序列。利用蛋白分析工具对母肽及其衍生肽的理化参数、不同形式二级结构占比及分布和空间结构进行了模拟与分析;使用抗菌肽预测工具CAMP对衍生肽进行了抗菌活性预测,表明了衍生肽的设计在理论上的合理性。一系列生物信息学工具显示,衍生肽LFcinB-L1综合平分最高,其疏水性残基的比例提高到56%,电荷数为+8,具有与母肽相近的二级结构及空间结构,因此,本文选择衍生肽LFcinB-L1合成基因并构建表达载体。(2)使用Snapgene软件数据库中毕赤酵母密码子优化表对衍生肽LFcinB-L1基因的密码子进行优化,使其适应于酵母GS115菌株表达。利用T4-DNA连接酶将经人工优化且成功合成的LFcinB-L1基因片段与线性化的p PIC9K载体连接成为分泌型表达重组载体p PIC9K-LFcinB-L1。基因测序结果表明长度为75 bp的LFcinB-L1基因成功克隆至质粒p PIC9K,重组载体构建成功。(3)利用限制性内切酶Sac I-HF对重组载体p PIC9K-LFcinB-L1单酶切,使其线性化,然后转化至酵母GS115宿主菌,使用甲醇进行诱导发酵,分泌性表达出衍生肽LFcinB-L1。探究和优化发酵条件,得其最适发酵条件为诱导时间:72 h,甲醇浓度:2%。使用琼脂板扩散法对比分析衍生肽LFcinB-L1与母肽LFcinB的抗菌活性,结果显示LFcinB-L1对金黄色葡萄球菌的抗菌活性比母肽LFcinB高约2倍。(4)使用400 m L发酵上清液制备的冻干粉质量为8.59 g。使用福林酚法检测冻干粉中衍生肽含量,测得多肽在冻干粉中含量占比约为37.19%。(5)检测衍生肽LFcinB-L1对不同菌种的抑菌作用,结果表明LFcinB-L1对金黄色葡萄球菌(G~+)、大肠杆菌(G~-)和枯草芽孢杆菌(G~+)均具有良好的抑菌效果。(6)利用Ecc15感染模式生物黑腹果蝇构建果蝇结肠炎模型,该果蝇模型肠道屏障功能受损、肠道缩短、寿命缩短,肠道内ROS升高,抗氧化相关基因的m RNA水平和抗氧化相关蛋白酶活性升高。在食物中添加衍生肽LFcinB-L1及母肽LFcinB,能减少果蝇结肠炎模型体内载菌量、降低细菌活力,降低过量的ROS,回调果蝇结肠炎模型体内抗氧化相关蛋白酶活性,进而修复肠道屏障功能、维持果蝇肠道形态,延长受感染果蝇的寿命,并且衍生肽LFcinB-L1在体内表现出比LFcinB更好的抗感染活性。(7)初步探究衍生肽LFcinB-L1对金黄色葡萄球菌的抑菌机制,其最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)分别为2 mg/m L和5 mg/m L。检测衍生肽LFcinB-L1对金黄色葡萄球菌的细胞表面疏水性、培养液中胞外碱性磷酸酶活性、β-D-半乳糖苷酶活性和核酸分子的影响。实验结果表明,LFcinB-L1降低菌体细胞表面疏水性,增加细胞壁和细胞膜的通透性,破坏菌体细胞膜的完整性,导致胞内的β-D-半乳糖苷酶及核酸大分子物质的泄漏;此外,衍生肽LFcinB-L1不影响金黄色葡萄球菌基因组稳定性,但会导致胞内蛋白含量显著降低,且出现部分蛋白的缺失,并且,衍生肽LFcinB-L1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著强于母肽。综low-density bioinks上,本文以LFcinB为模板,设计改造出衍生肽LFcinB-L1,在酵母中分泌性表达并纯化,该衍生肽在体外可抑制革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌生长,且抑菌活性比母肽高两倍以上;在肠道内可抑制病原菌生长,从而减轻由ECC15感染的果蝇结肠炎模型的一系列疾病表型。此外,探究其对金黄色葡萄球菌的抑菌机制表明该衍生肽通过破坏细胞膜及抑制蛋白表达抑制细菌生长。本研究设计、改造并获得具有高抗菌活性的抗菌肽,优化发酵条件及多肽纯化条件,并初步探究其抗菌机制,为开发高产、高效并且作用机制明确的新型抗菌肽提供理论依据,对将来人类的卫生健康和畜牧行业的稳定发展具有重要的应用指导意义。