硫元素在自然界中以及生物体内广泛存在,含硫天然产物是一大类重要的功能性分子,其良好的生理活性以及复杂的化学结构引起了人们的广泛关注和研究。许多含硫天然产物表现出强大的生物活性和药理特性,其中一些分子已经被开发为重要的药物并且临床上广泛应用了。硫肽类抗生素作为含硫天然产物中的一员,具有良好的抗菌、抗癌等生物活性被人们所熟知。其中,双环硫肽分子诺西肽(Nosiheptide,NOS)因其独特的分子结构以及良好的抗菌活性得到了各个领域的科学家们广泛的研究。其侧环部分含有一个独立于前体肽之外的吲哚酸单元(3-methyl-2-indolyl acid,MIA),这一部分对其抗菌效果具有重要影响。含有硫元素的苯并[b]噻吩结构与MIA结构非常相近,目前仅报道过一种含有天然产物中发现过该结构。然而苯并噻吩结构单元作为一个药效单元,其衍生物在众多种类的药物中存在并且具有良好的效果。所以,本课题选择了苯并噻吩酸(3-methyl-2-benzothiophenic acid,MBA),希望通过化学喂养的方法,将MIA单元替换为MBA单元,通过生物合成的手段,在含硫天然产物中引入含有硫元素的苯并噻吩结构,从而获得NOS类似物。首先,将原始菌株Streptomyces actuosus ATCC 25421中控制MIA单元生成的nos L基因敲除的突变株SL4005作为被喂养菌株进行发酵条件优化。在最适条件下,对SL4005突变株进行一级发酵并喂养MBA。在发酵液中,HPLC检测到了三种双环NOS类似物:S-NOS-1、S-NOS-2和S-NOS-3。其中S-NOS-1的发酵产量非常低。对S-NOS-2和S-NOS-3进行结构鉴定可以看出这两种NOS类似物都是翻译后修饰不完全的产物,需要对其进行进一步的后修饰才能得到氧化成熟的NOS类似物S-NOS-1。这也说明MBA单元的引入因为翻译后修饰酶的特异性识别而导致催化效率降低。在NOS生物合成Adezmapimod基因簇中,脱酰胺化酶Nos A以及P450氧化酶Nos B和Nos C负责NOS的翻译后修饰,将其氧化成成熟的NOS分子。所以为了提高成熟的S-NOS-1的产量,本课题构建了四种翻译后修饰酶多拷贝的菌株。其中,nos A、nos B和nos C同时倍增的突变株SL7001的S-NOS-1的产量提高了9倍。在该突变株中,S-NOS-2的产量基本不变,而S-NOS-3的产量明显下降,可以推测出其在体内的主要氧化成熟路径是S-NOS-3先被Nos B对6位谷氨酸进行羟化得到中间体,随后被Nos C和Nos A进一步修饰得到成熟的NOS类似物S-NOS-1。最后,将得到的NOS类似物S-NOS-1、S-NOS-2、S-NOS-3与NOS、NOS1260、Van作为对照进行多株肠球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性检测。结果显示,翻CP-456773分子式译后修饰完全的S-NOS-1与NOS维持着相似的抗革兰氏阳性Antiviral immunity菌的活性,并且对临床耐药菌VRE和MRSA也具有很好的抑制效果。而修饰不完全的S-NOS-2和S-NOS-3的抗菌活性略有降低,但其效果也远高于临床用药万古霉素。总而言之,本课题成功的通过生物合成的方法向天然产物分子中引入含硫药效单元苯并噻吩类似物MBA,并分离得到了三种抗菌活性良好的NOS类似物。该方法可以作为一种向复杂天然产物分子中引入硫元素的新策略,也为向天然产物中引入苯并噻吩结构奠定了基础。