帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要的病理学特点是黑质中多巴胺能神经元的丢失,以及路易小体的形成。路易小体的主要成分为α-突触核蛋白。目前治疗PD的方法主要为药物治疗,主要使用的药物为多巴胺类似物、多巴胺能受体激动剂、神经保护剂、单胺氧化酶-B(MAO-B)抑制剂等。然而,大多数治疗PD的药物都有一定毒性,所以,寻找一种安全性高且疗效好的药物便成为对PD进行治疗的当务之急。根据现LY-188011体内实验剂量有研究,对于PD模型来说,虽然去亚甲基小檗碱(demethyleneberberine,DMB)具有一定的保护作用,但其实现保护作用的机制尚不清楚。因此,本实验应用SH-SY5Y细胞系建立PD细胞模型,采用分子生物学等研究方法,对DMB在PD中的保护作用进行探讨,并分析其可能的机制。在实验时采用已被证实具有神经保护作用的DMB的前体——黄连素(小檗碱,berberine,BBR)以及同样被证明具有神经保护作用、和DMB同为MAO-B抑制剂的司来吉兰(Selegiline)与DMB对比形成阳性对照。实验结果如下:1.不同浓度的DMB(0、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)、10~(-2)、10~(-1)、1、10、100μM)处理SH-SY5Y细胞24 h,各浓度药物对细胞存活率均无明显影响。1 m M MPP~+处理24 h,细胞存活率降低至37%(P<0.001)。10~(-5)-100μM的DMB与MPP~+共处理可显著提高细胞存活率。其中,10~(-3)μM的DMB与MPP~+共处理组的SH-SY5Y细胞存活率最高(P<0.001)。因此,选择10~(-3)μM的DMB作为最佳浓度进行后续实验。2.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)水平显著降低,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平显著升高。与MPP~+处理组相比,DMB抑制了Δψm的降低(P<0.001)和ROS的增加(P<0.001)。三种药物处理对medium entropy alloyΔψm和ROS的作用效果均无明显差异(P>0.05,P>0.05)。3.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞bcl-2/bax比值下降。DMB处理抑制了bcl-2/bax比值的下降(P<0.001)。三种药物处理组之间相比,司来吉兰的作用效果要强于BBR和DMB(P<0.05,P<0.05)。4.与对照组相比,MPP~+处理组细胞的cleaved caspase-3蛋白表达上调。DMB处理抑制了cleaved caspase-3蛋白表达的上调(P<0.001)。三种药物处理的效果并无明显差异(P>0.05)。5.与对照组相比,MPP~+处理组selleck激酶抑制剂的细胞酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达显著降低(P<0.001)。DMB处理可显著抑制TH表达的降低(P<0.001)。三种药物处理的效果并无明显差异(P>0.05)。6.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞磷酸化Akt蛋白的表达显著降低(P<0.001)。DMB处理可抑制磷酸化Akt蛋白表达降低(P<0.001)。三种药物处理组之间相比,司来吉兰和DMB的作用效果均强于BBR(P<0.001,P<0.001),且司来吉兰的作用效果也强于DMB(P<0.001)。不同处理组之间Akt总蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。7.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞磷酸化AMPK蛋白的表达增加(P<0.05)。DMB处理后AMPK磷酸化水平进一步增加且高于MPP~+处理组(P<0.001)。三种药物处理组之间相比,司来吉兰和DMB的作用效果均强于BBR(P<0.001,P<0.001)。不同处理组之间AMPK总蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。8.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞p62蛋白的水平升高(P<0.001)。DMB处理可以促进p62蛋白的降解(P<0.001)。三种药物处理组之间相比,BBR作用效果要强于司来吉兰(P<0.01)。9.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞cleaved caspase-8的表达水平显著升高(P<0.001)。DMB处理可以抑制cleaved caspase-8的表达升高(P<0.001)。三种药物处理组之间相比,司来吉兰的作用效果要强于BBR(P<0.05)。10.与对照组相比,MPP~+处理组的细胞MAO-B水平显著升高。DMB处理可以抑制MAO-B水平的升高(P<0.01)。三种药物处理组之间相比,司来吉兰的作用效果强于BBR(P<0.05)。以上结果表明,在MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞中,DMB可以维持线粒体膜电位,并降低ROS水平,抑制TH蛋白表达的降低;亦可以抑制线粒体相关的caspase依赖性凋亡通路。DMB可以激活细胞Akt、AMPK信号通路,并促进p62降解,进而维持细胞线粒体稳态,并抑制caspase-8凋亡通路。DMB可以降低细胞中MAO-B的水平,抑制多巴胺氧化脱氨,并促进线粒体稳态的维持。提示DMB的保护作用可能是通过与线粒体相关的多种途径实现的。