脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是指原发性脑实质内出血,具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点。ICH后的原发性脑损伤(Primary brain injury,PBI)和继发性脑损伤(Secondary brain injury,SBI)是导致高死亡率及高致残率的主要原因。炎症反应和细胞凋亡在ICH后SBI中起着重要作用。研究表明,小胶质细胞在ICH病变周围被激活后表现为促炎表型(M1)和抗炎表型(M2),促进小胶质细胞表型转化为M2型,可最大程度发挥其抗炎和抗凋亡作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)是一种转录因子。通过ICH体内和体外实验研究均发现激活PPARγ,有利于促进血肿周围小胶质细胞转化为M2型,减轻大鼠ICH后神经功能缺损,且PPARγ抑制剂GW9662可消除其保护作用。故通过PPARγ调节小胶质细胞表型转化为M2型,是治疗ICH的重要干预靶点。ICH在中医学中归属于“中风”范畴,现代多称作“出血性中风”以区别“缺血性中风”。中医药治疗出血性中风一直受到广泛重视。阴阳失调,气血逆乱,上冲犯脑,血溢脑脉之外是出血性中风的基本病机。根据此病机创立的安脑平冲方为湖南中医药大学第一中医临床学院脑病一科治疗出血性中风的协议方,该方以平冲降逆、通调气血为主要治法,多年来广泛用于临床,具有显著的临床疗效,但缺乏实验水平及分子机制研究。本研究主要目的是首先从体外研究水平探讨安脑平冲方含药血清(A-HYXQ)是否能调节小胶质细胞表型以及其可能的分子机制;其次,从体内实验进一步探讨安脑平冲方在大鼠ICH后通过对小胶质细胞表型的调节能否减轻大鼠ICH后的SBI以及可能的分子机制,最终为安脑平冲方治疗ICH提供新依据,为中医药治疗ICH提供新思路和新理念。第一部分体外实验目的:探讨安脑平冲方含药血清(A-HYXQ)对氯化血红素(Ferriheme chloride,Hemin)损伤BV2小胶质细胞的保护作用。方法:采用Hemin损伤BV2小胶质细胞,构建ICH后炎症反应的体外研究模型。筛选最佳浓度Hemin和A-HYXQ后,实验分为三组:对照组、模型组、A-HYXQ组。通过免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和蛋白印迹(Western blot,WB)方法检测M2小胶质细胞标志物壳多糖酶3样蛋白(Chitinase-likeProtein 3,Ym1)和白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的表达水平,以及M1小胶质细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)的表达水平。结果:与对照组相比,模型组M2小胶质细胞标志物(Ym1和IL-10)的表达水平明显下降(P<0.05),M1小胶质细胞标志物(i NOS和IL-6)的表达水平明显上升(P<0.05);与模型组相比,A-HYXQ组可显著降低i NOS和IL-6的表达水平(P<0.05),同时升高Ym1和IL-10的表达水平(P<0.05)。结论:A-HYXQ可通过调控小胶质细胞表型转化为M2型减轻Hemin损伤BV2小胶质细胞的炎症反应。第二部分体外实验目的:探讨A-HYXQ对Hemin损伤BV2小胶质细胞的保护作用的分子机制。方法:采用Hemin损伤BV2小胶质细胞,构建ICH后炎症反应的体外研究模型。筛选最佳浓度PPARγ抑制剂GW9662,采用PPARγ激动剂GW1929作为阳性对照。实验分为五组:对照组、模型组、A-HYXQ组、A-HYXQ+GW9662组、GW1929组。通过IF、WB和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法检测M2小胶质细胞标志物PPARγ、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)和白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)的表达水平;通过WB、q RT-PCR和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测M1小胶质细胞标志物肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。结果:与对照组相比,模型组PPARγ、Arg-1和IL-4的表达水平明显降低(P<0.05),而TNF-α和IL-1β的表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,A-HYXQ组和GW1929组可显著降低TNF-α和IL-1β的表达水平(P<0.05),同时显著升高PPARγ、Arg-1和IL-4的表达水平(P<0.05);与A-HYXQ组相比,A-HYXQ+GW9662组PPARγ、Arg-1和IL-4的表达水平明显下降(P<0.05),TNF-α和IL-1β的表达水平显著上升(P<0.05);与A-HYXQ组相比,GW1929组的PPARγ和Arg-1上升更加显著(P<0.05),IL-1β下降更明显(P<0.05),而IL-4和TNF-α表达水平无明显统计差异(P>0.05)。结论:1.激活PPARγ信号通路可调控小胶质细胞表型转化为M2型,减轻Hemin损伤BV2小胶质细胞的炎症反应。2.A-HYXQ可能通过激活PPARγ信号通路调控小胶质细胞表型转化为M2型,减轻Hemin损伤BV2小胶质细胞的炎症反应。第三部分体内实验目的:基于PPARγ信号通路极化M2小胶质细胞,探讨安脑平冲方减轻大鼠ICH后SBI的作用及作用机制。方法:采D-Lin-MC3-DMA体内实验剂量用自体动脉血注入大鼠左侧大脑基底节区建立ICH体内研究模型。雄性Sprague Dawley(SD)大鼠被随机分为四组:假手术组、模型组、安脑平冲方组、安脑平冲方+GW9662组。在大鼠ICH后1d、3d和7d三个不同时间点采用大鼠神经功能缺损评分(Modified neurological severity score,m NSS)、前肢放置实验及转角实验评估大鼠ICH后的神经功能缺损;采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察血肿周围脑组织结构及炎性细胞浸润情况;确定后续实验研究时间点为7d后,采用干湿比重法检测大鼠脑组织的含水量;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP原位切口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)染色观察血肿周围脑组织凋亡细胞,并计购买Baf-A1算其细胞凋亡率;采用WB和q RT-PCR方法检mechanical infection of plant测血肿周围脑组织与凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、BCL2关联X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平和信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,m RNA)的表达水平;通过IF、WB、q RT-PCR和ELISA方法检测血肿周围M2小胶质细胞标志物(PPARγ、Arg-1和IL-4)的表达水平和M1小胶质细胞标志物(TNF-α、IL-1β)的表达水平。结果:与对照组相比,模型组m NSS评分明显上升(P<0.05),右侧前肢放置成功率和向右转次数概率均明显下降(P<0.05),血肿周围脑组织炎性细胞浸润明显增多,血肿周围细胞凋亡数目和脑含水量明显增加(P<0.05),血肿周围Bcl-2、PPARγ、Arg-1和IL-4表达水平明显降低(P<0.05),而Bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β表达水平明显上升(P<0.05);与模型组相比,安脑平冲方组m NSS评分明显下降(P<0.05),右侧前肢放置成功率和向右转次数概率均明显上升(P<0.05),血肿周围脑组织炎性细胞浸润明显减少,血肿周围细胞凋亡数目和脑含水量明显减少(P<0.05),血肿周围Bcl-2、PPARγ、Arg-1和IL-4表达水平明显增高(P<0.05),而Bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β表达水平明显下降(P<0.05);与安脑平冲方组相比,安脑平冲方+GW9662组的m NSS评分显著增加(P<0.05),右侧前肢放置成功率和向右转次数概率均明显下降(P<0.05),血肿周围脑组织炎性细胞浸润增多,血肿周围细胞凋亡数目和脑含水量明显增加(P<0.05),血肿周围的Bcl-2、PPARγ、Arg-1和IL-4表达水平明显下降(P<0.05);而Bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β表达水平显著上升(P<0.05)。结论:安脑平冲方可能部分通过激活PPARγ信号通路调控小胶质细胞表型转化为M2型,减轻大鼠ICH后血肿周围组织的炎症反应和细胞凋亡,减轻脑水肿,从而减轻了大鼠ICH后的SBI,最终达到改善大鼠ICH后神经功能预后的目的。