中药挥发油是芳香药物防治疾病的物质基础,理化性质独特、生物活性显著,易随时间自发陈化,改变物质组成,影响品质。阐明其陈化规律与机制,是科学认识、优效应用与系统开发挥发油的关键。部分中药挥发油陈化后可起到减毒存效、缓性增香的作用,极具研究价值。由于细辛挥发油“量效”和“量毒”关联规律不明确,“减毒存效”方法缺失,影响临床安全用药。本课题以细辛挥发油(Asarum essential oils,AEO)为研究对象,研究其成分-毒/效的相关规律,建立细辛挥发油安全评价标准,确定细辛挥发油“减毒存效”的安全治疗窗,证实“减毒存效”的客观实效。研究不同形态催陈方法的适宜性和可行性,为快速制备高品质挥发油提供技术参考。本课题主要研究内容如下:1、细辛挥发油成分与镇痛、神经毒性的相关靶点和通路的预测采用网络药理学和网络毒理学对PubChem、NCBI、GEO、GeneCards、SwissTargetPrediction等数据库进行关键词为“细辛与牙痛”,“细辛与神经毒性”的数据挖掘,建立AEO与牙痛,AEO与神经毒性相关的网络关系,揭示AEO治疗牙痛和产生神经毒性的相关靶点和通路。通过网络图分析发现AEO通过肉豆蔻醚、γ-细辛醚和甲基丁香酚等关键成分影响PPARA、ACHE、SLC6A4、NOS3和HTR2A等靶点进而影响HIF-1信号通路、钙信号通路及5-羟色胺能突触,以实现治疗牙痛的目的。通过网络图分析发现细辛挥发油通过榄香素、γ-细辛醚和肉豆蔻醚等关键成分影响ACHE、ESR1和PARP1等靶点进而影响催乳素信号通路,出现神经毒性。2、细辛挥发油抗炎镇痛作用研究采用小鼠醋酸扭体模型进行细辛挥发油镇痛实验,以小鼠扭体次数作为评价指标。实验结果表明细辛挥发油低中高(107.92、161.88、215.84 mg/kg)剂量均有效减少了因醋酸造成的小鼠扭体现象,由44次减少至23次,证明AEO确实具有明显镇痛作用。通过脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症模型进行细辛挥发油抗炎活性研究,以炎症因子IL-6和TNF-α作为抗炎水平评价指标。实验证明,LPS诱导后RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6的表达显著增加,AEO干预后,可降低炎症因子TNF-α和IL-6的增加(P<0.01),证明AEO确实具有抗炎活性。通过抗炎活性和镇痛作用证实AEO是细辛的主要药理活性成分。3、细辛挥发油的毒性及机制研究使用AB系斑马鱼模型进行AEO急性毒性实验,给药后观察胚胎形态和生存率,实验证明AEO对斑马鱼的半数致死浓度为0.174μL/mL(相当于170.346mg/L),根据鱼类急性毒性分级标准(GB/T21281-2207),LC_(50)>100 mg/L为低毒,表明细辛挥发油具有低毒性,高剂量给药可观察到其具有致畸性。使用KM小鼠进行AEO急性毒性实验,LD_(50)为1.9116 g/kg,根据经口急性毒性分级标准,细辛挥发油口服具有低毒性。给药后观察到小鼠出现走路摇晃现象,呈醉酒状,分析其产生神经毒性。监测小鼠体重和脏器比,表明高剂量给药组与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)。对小鼠血清和组织进行生化指标检测和组织病理学观察,小鼠血清和组织生化指标结果显示,肝组织中AEO组的AKP、ALT、AST和MDA的含量明显高于空白组,心脏组织中AEO组GSH含量显著降低(P<0.05)。组织病理学结果表明,给药后各组织均出现不同程度的损伤,组织结构紊乱,细胞核排列及走向紊乱,有炎性浸润等现象。小鼠毒性实验观察分析AEO对小鼠产生神经毒性,为进一步考察其毒性机制,对小鼠脑组织进行转录组学检测与分析,预测细辛挥发油产生毒性的相关蛋白及通路。GO和KEGG的功能富集分析结果显示其主要富集在氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)、细胞凋亡(Apoptotic process)、线粒体内膜蛋白复合物(Inner mitochondrial membrane protein complex)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)和催产素信号通路(Oxytocin signaling pathway)等,推测AEO神经毒性与细胞凋亡和氧化应激相关。4、细辛挥发油成分分离与毒效研究上述实验结果表明细辛挥发油具有较好抗炎活性和镇痛作用,但同时存在低毒性,毒性存在影响其临床广泛应用,因此实现减毒至关重要。减毒的本质即物质基础改变,需首先了解细辛挥发油中影响毒效的相关成分。采用分子蒸馏技术对AEO进行成分分离和富集,研究不同馏分挥发油的化学成分、抗炎活性和毒性。分子蒸馏将细辛原油(Crude oil,C)分离为3个馏分:重馏分(Heavy Fraction,H)、中馏分(Medium Fraction,M)和轻馏分(Light Fraction,L),H实现了甲基丁香酚和醚类成分富集,甲基丁香酚由原油中的24.0203%增加至31.3644%,醚类成分由69.4369%增加至86.2078%;而M和L中单萜烯类成分实现富集,L中α-蒎烯和β-蒎烯相对百分含量之和为39.5302%,是原油的5倍,醚类成分仅含有5.8280%,是原油的0.08倍。通过LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型实验研究表明,与模型组相比,AEO及3个馏分TNF-α和IL-6的表达明显降低(P<0.01),发挥抗炎作用,抗炎活性大小为L>M>H/C。根据成分-抗炎活性相关性分析可知,影响AEO抗炎活性的物质主要包括:甲基丁香酚、肉豆蔻醚、α-蒎烯和β-蒎烯。小鼠急性毒性实验结果表明C、H和M的LD_(50)分别为:1.8852、1.9566和3.6741 g/kg,而L在给药剂量升至为5.1349 g/kg时,小鼠死亡率为0。证明L的毒性远小于C、H和M,M毒性与C相比明显降低(P<0.01),H与C毒性相近。根据成分-毒性相关性分析可知,与AEO产生毒性相关的主要化学成分包括黄樟醚、甲基丁香酚和肉豆蔻醚等醚类物质。利用PC12细胞进行细辛挥发油神经毒性分析,结果证实细辛挥发油可诱导PC12细Bioprocessing胞MK-4827作用线粒体发生氧化损伤和功能障碍,细胞形态发生明显变化,细胞核异常,凋亡细胞增多。采用Annexin V-FITC双染法检测了AEO处理的PC12细胞凋亡率,结果显示,AEO处理后,PC12细胞凋亡率增加,表明AEO能诱导PC12细胞凋亡。实验结果表明AEO产生神经毒性与细胞凋亡和氧化应激相关。AEO中甲基丁香酚和肉豆蔻醚等是发挥药效和毒性的共性成分,正确把握其比例变化是实现“减毒存效”的关键。5、阐明细辛挥发油“成分-毒/效”的关系,建立“醚/烯比值”安全评价标准根据相关性分析结果表明细辛挥发油中甲基丁香酚、黄樟醚和肉豆蔻醚不仅是细辛挥发油中有效成分,也是其主要的毒性成分。因此,需要控制AEO毒-效相关性成分含量,建立符合AEO安全评价标准,从而实现“减毒存效”的目标。采用分子蒸馏技术分离制备8个含有AEO特征性成分的组分(A-H)。使用GC-MS进行成分分析,斑马鱼急毒考察挥发油毒性,LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型研究挥发油抗炎活性。GC-MS结果表明在8个组别中,醚类相对百分含量分别为:61.11、67.11、71.36、37.03、68.25、70.63、68.59和53.79%;单萜烯类相对百分含量分别为:16.12、4.25、13.91、52.45、6.10、5.50、9.46和33.49%。IL-6和TNF-α的含量结果表明与LPS诱导模型组相比,地塞米松组和A-H组3种浓度(0.5、0.25和0.125μL/mL)的释放量呈下降趋势,具有显著性差异(P<0.05)。斑马鱼毒性实验结果得到8个组分斑马鱼毒性大小为:F、G>E>B>C>A>H>D。将斑马鱼的毒性结果与6种形式成分含量进行相关性分析:?醚类百分含量;?单萜烯类相对百分含量;?醚类和单萜烯类相对百分含量之比;?甲基丁香酚、黄樟醚、3,5-二甲氧基甲苯、3,4,5-三甲氧基甲苯和肉豆蔻醚相对百分含量之和;?甲基丁香酚和黄樟醚相对百分含量之和;?甲基丁香酚和黄樟醚相对百分含量比值。寻找“安全有效”的细辛挥发油组分为后续减毒实验提供目标组分。结果表明毒性与6种评价指标均具有显著相关性(P<0.05),AEO药效与单萜烯类成分、甲基丁香酚含量呈正相关,毒性与醚类成分黄樟醚和甲基丁香酚含量呈正相关。因此为同时兼顾AEO的毒性和药理活性,避免出现毒减效减的现象,选择醚类与单萜烯类比值作为AEO质量评价指标,比值降低即毒性下降,初步确定其理想比值范围为1.61～3.79。6、细辛挥发油陈化规律及机制的研究采用自然陈化、物理催陈和炮制催陈等方法进行细辛挥发油减毒研究,使用GC-MS进行成分检测,电子鼻、旋光仪、折射仪用于测定细辛挥发油的香气、旋光度和折光度。自然陈化对挥发油理化性质的影响:将提取的细辛挥发油放置在阴凉柜中(2-8℃),分别在第0、30、60、90、180和360天取样储存在-20℃冰箱中备用。通过GC-M成分分析表明,细辛挥发油自然陈化过程各成分相对含量无明显变化,而绝对含量在减少。斑马鱼的急毒实验表明,陈化360天后细辛挥发油LD_(50)为0.195μL/mL,与提取当天细辛挥发油LD_(50)相比(0天,0.174μL/mL)无显著性差异。小鼠的急毒性实验结果表明,陈化360天后细辛挥发油LD_(50)与提取当天的细辛挥发油LD_(50)相比无显著性差异。物理催陈对细辛挥发油理化性质影响:用红外光、紫外光、白炽光、高温和微波对细辛挥发油陈化进行干预,检测不同催陈条件下挥发油的理化性质,探讨催陈对细辛挥发油理化性质的影响,寻找实现“减毒存效”的催陈工艺。结果表明微波催陈对细辛挥发油的理化性质产生影响,900W密闭催陈后细辛挥发油单萜烯类成分减少,而醚类成分增加。AEO经微波催陈后醚类和单萜烯类比值呈增加趋势,与目标趋势相反。密度和折光率也随着成分的变化发生改变。紫外、高温和白炽灯光照条件下AEO的理化性质均未发生明显改变。在红外光线的照射下,生成2种新物质β-罗勒烯和桧烯,同时AEO中发生成分结构转变,由左旋-α-蒎烯转化为右旋-α-蒎烯,2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1,3-环己二烯转化为1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯,1,8-萜二烯转化为1-亚甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烷。成分的转变改变AEO物质基础进而影响其药理活性和毒性,有待进一步研究红外光照对挥发油的影响。炮制催陈对细辛挥发油理化性质影响:使用传统的炮制手段盐炙、醋制、蜜炙、碱制、碱醋制、蜜制、炒制以及微波炮制对细辛药材进行处理,提取细辛挥发油,测定其理化性质,比较成分的差异性,探索炮制减毒的可行性。结果表明,炮制会对细辛挥发油理化性质产生影响。未经炮制直接提取的细辛挥发油醚类和单萜烯类的比值为5.66,多种炮制工艺均可使比值降低,表明减小毒性。其中酒炙(3.37)和盐炙(4.03)可显著降低AEO的毒性,研究两种炮制工艺的条件对AEO成分变化的影响,考察其作为减毒方法的可行性,为细辛挥发油安全有效的使用和开发利用奠定实验基础。进一步证明中药炮制的意义与价值,猜测古人使用细辛炮制实现减毒机理可能与降低“醚烯比”相关。综上,通过细辛挥GNE-140供应商发油成分-毒/效相关性研究,建立以“醚/烯比”为指标的细辛挥发油安全评价标准。探讨陈化方法对细辛挥发油“减毒存效”可行性分析,阐明炮制催陈减毒的机理,为有毒芳香中药提供减毒的新思路。