阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以记忆丧失、认知障碍以及痴呆的行为和心理症状为特征的神经退行性疾病。AD最突出的病理特征是神经元外β-淀粉样蛋白(beta-amyloid peptides,Aβ)异常沉积形成的老年斑和tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neuronal Fiber Tangles,NFT)。AD还有一些神经病理学特征如神经兴奋性和网络活动增加、出现癫痫活动、神经振荡减慢和波形复杂性降低等。可溶性的β淀粉样蛋白寡聚体(oligomeric amyloid-β,oAβ)是AD的上游致病因素,通过突触驱动机制导致超兴奋性的产生和传播,对大鼠和小鼠模型的初级神经元产生毒性作用,如抑制Dionysia diapensifolia Bioss海马突触长时程增强,并导致学习记忆障碍。oAβ的主要形式为oAβ1-40和oAβ1-42,并且后者的毒性最强。因此抑制oAβ1-42的毒性作用可能是保护海马神经元减少损伤的重要病理机制。对AD神经元功能障碍和毒性的最早解释之一是由Arispe等人首先提出的通道假说,该假说假设不受调控的Aβ离子通道会导致离子稳态的丧失(主要是通过升高细胞内钙离子),触发神经元超兴奋,最终导致神经毒和细胞死亡。二苯基吡唑化合物Anle138b,是一种低聚物调节剂,毒性低,在治疗剂量下检测不到毒性,口服生物利用度高,并且具有良好的血脑屏障通透性。Anle138b能够阻断Aβ通道并改善淀粉样变性小鼠模型的疾病表型。我们的前期工作表明,Anle138b无论是以预防性给药还是治疗性给药都能对抗oAβ1-42诱导海马神经元的毒性作用,但其作用机制仍不明了,尤其Anle138b能否保护大鼠海马神经元对抗oAβ1-42诱导的海马神经元超兴奋,仍不清楚。本实验选取出生24h之内的SD幼鼠为实验材料,在原代培养海马神经元的基础上,应用oAβ1-42(STM2457 NMR100 nmol/L)连续处理海马神经元7天诱导海马神经元超兴奋。使用Anle138b预孵育,建立Anle138b保护oAβ1-42诱导的AD模型。应用乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)试剂盒和单细胞膜片钳技术,探究Anle 138b能否对抗oAβ1-42诱导的大鼠海马神经元超兴奋和神经毒性反应。实验结果如下:1.对大鼠原代海马神经元进行电生理和形态学特征鉴别。结果显示,当施加40 pA去极化电流刺激时,非锥体神经元动作电位平均放电频率明显快于(11.74±0.76 Hz)锥体神经元(5.45±0.65 Hz),差别具有统计学意义(P<0.001)。本实验选用锥体神经元。2.将培养的大鼠原代海马神经元,使用100 nmol/L的oAβ1-42连续处理7天,当给予海马神经元40 pA去极化电流刺激后,与对照组相比,oAβ1-42组动作电位放电频率明显增加(P<0.001),LDH释放量也明显增加(P<0.05),表明慢性oAβ1-42处理诱导原代培养的海马神经元出现超兴奋和毒性反应,可以作为一种细胞selleck CX-5461毒性反应模型。3.当给予40 pA的去极化电流刺激后,与对照组相比,单独不同浓度Anle138b(10,50,100 nmol/L)处理不影响动作电位放电频率(P>0.05),表明以上三个浓度的Anle138b本身对海马神经元不产生影响,因此可以用于本研究的神经保护实验。4.单细胞膜片钳记录显示,当施加海马神经元施加10、20、30、40 pA的去极化电流刺激时,可诱发动作电位放电频率不断增加,形成输入-输出曲线。与单独oAβ1-42处理组相比,oAβ1-42+Anle138b处理组明显下移了输入-输出曲线。对动作电位放电频率输入-输出曲线斜率的统计表明,与对照组比较,慢性oAβ1-42处理可诱导培养的海马神经元超兴奋(P<0.001),而Anle138b可降低oAβ1-42 诱导的超兴奋(P<0.05),差异具有统计学意义,表明Anle138b可以预防慢性oAβ1-42处理诱导的海马神经元超兴奋,起到神经保护作用。5.对动作电位参数分析结果表明,当给予海马神经元40 pA的去极化电流刺激时,与oAβ1-42组相比,Anle138b和oAβ1-42共处理组,延长了动作电位的起始时间(P<0.05)和增大了后超级化电位幅值(P<0.001)。6.单细胞膜片钳记录显示,当给予海马神经元40 pA的去极化电流刺激时,与单独使用oAβ1-42组相比10 nmol/L Anle138b组海马神经元动作电位的放电频率无明显变化(P>0.05),而50 nmol/L,100 nmol/L的Anle138b组都降低了海马神经元动作电位的放电频率(P<0.001;P<0.01)。7.当给予海马神经元40 pA的去极化电流刺激时,oAβ1-42处理5天即可诱导海马神经元过度兴奋(P<0.001),并且在oAβ1-42处理5天后单独使用海马神经元培养液2天和5天,海马神经元依然保持过度兴奋(P<0.001)。8.与单独使用oAβ1-42处理5天组相比10 nmol/L Anle138b组海马神经元放电频率无明显变化(P>0.05),而 50 nmol/L,100 nmol/L 的 Anle138b 与 oAβ1-42共处理两天都可以降低oAβ1-42诱导的已形成的海马神经元超兴奋(P<0.01;P<0.05),表明>50 nmol/L的Anle138b能够翻转已形成的海马神经元超兴奋。9.当电压钳制到-70 mV时,Anle138b(100 nM)本身对海马神经元兴奋性突触功能没有影响(P>0.05),与对照组相比,oAβ1-42组幅值和半衰减时间没有明显变化(P>0.05),但是频率明显增加(P<0.001),与oAβ1-42组相比,oAβ1-42+Anle13 8b组和oAβ1-42+Anle138b 2days组幅值和半衰减时间没有明显变化(P>0.05),但频率明显降低(P<0.0001),表明Anle138b可以降低突触前谷氨酸的释放。综上所述,使用oAβ1-42连续给药7天慢性处理海马神经元会导致其出现超兴奋和毒性反应,因此可以作为oAβ1-42细胞毒性反应模型。我们使用该模型来评估Anle138b对oAβ1-42诱导的海马神经元超兴奋的影响。发现Anle138b不仅能够预防慢性oAβ1-42诱导的海马神经元超兴奋和突触毒性反应外,还能够消除oAβ1-42诱导的已形成的海马神经元超兴奋和突触毒性反应。Anle138b的作用机制包括改变突触后神经元的离子通道功能和减少突触前的谷氨酸的释放。因此像Anle138b这种小分子阻断剂在AD的治疗中可能有非常大的潜力,值得进一步研究。