研究背景抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相关性血管炎(ANCA associated vasculitis,AAV)是以累及全身各系统小血管为主的坏死性小血管炎。其临床分类主要分为显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis,MPA)、肉芽肿性多血管炎(granulomatous polyangiitis,GPA)和嗜酸细胞肉芽肿性血管炎(eosinophilic granulomatous vasculitis,EGPA)。自身抗体ANCA所识别的自身抗原主要包括髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和蛋白酶3(proteinase-3,PR3)。其中,我国以MPO-ANCA阳性AAV(MPO-AAV)多见,临床多表现为MPA。ANCA不仅是AAV的特征性血清生物标志物,也是其致病因素之一。研究显示AAV发病机制复杂,除自身抗体ANCA外,多种其他因素可能参与AAV的发病。已有研究报道,外泌体中非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)在多种疾病(包括自身免疫病)发病机制中发挥重要作用,但在AAV的起病和病情变化过程中,外泌体中nc RNA表达水平的变化和其在AAV临床诊疗中的意义以及nc RNA在AAV血管损害中的可能作用机制等方面,目前未见研究报道。鉴于我国最常见MPA属于MPO-AAV,MPA最常见的血管炎损害累及肾血管,临床表现为肾小球肾炎。故本研究与健康对照相比较,探讨MPO-AAV患者外周血外泌体nc RNA中的微小RNA(micro RNA,mi RNA)的表达水平差异,分析其差异与临床指标间的关系,根据临床资料及生物信息分析结果,选择mi R-145-5p为深入研究对象,探索其在MPO-AAV发病中的作用及其分子机制。尝试为MPO-AAV的诊断、病情变化评估寻找新的潜在生物标志物,并为MPO-AAV未来的精准靶向治疗探索新的靶点。研究目的1.与健康对照组比较,探讨MPO-AAV活动期患者外周血血浆外泌体中差异表达的mi RNAs,并运用生物信息学方法预测这些差异表达的mi RNAs干预MPO-AAV发病的可能途径;2.筛选组间差异表达的外泌体mi RNAs并扩大样本量进行验证,分析其与常见临床化验室指标、BVAS(Activity of Systemic Vasculitis in Birmingham)评分和血清细胞因子表达水平之间的关系并绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC),讨论其作为潜在生物标记物的临床应用价值。综合以上结果,选择目标mi RNA深入研究;3.在细胞和动物水平,分别进一步探索选定的外泌体mi R-145-5p在MPO-AAV肾小球血管内皮损害中的可能作用及其发挥作用的分子机制。研究方法1.随机选择初发未治疗的MPO-AAV活动期患者及性别、年龄相匹配的健康对照各4例,应用超速离心法提取外周血血浆外泌体并通过透射电镜、粒GW4869说明书径分析和Western Blot方法鉴定。随后对外泌体mi RNAs进行高通量测序,应用R软件包差异分析基因算法对其进行深入分析,与健康对照比较,寻找差异表达的mi RNAs,分析MPO-AAV活动期患者外泌体中mi RNAs的上调和下调变化情况,结合生物信息学分析结果,初步genetic manipulation了解外泌体mi RNAs干预MPO-AAV发病的可能途径;2.另随机选择MPO-AAV病情活动期患者及性别、年龄匹配健康对照各40例,相同方法获取外周血血浆外泌体mi RNAs,用于扩大临床样本验证,根据测序结果筛选5个mi RNAs(hsa-mi R-130a-3p、hsa-mi R-145-5p、hsa-mi R-181c-5p、hsa-mi R-450a-5p和hsa-mir-582-5p)验证上述全转录组高通量测序结果;3.综合测序与验证结果,选取具有潜在深入探讨价值的目标mi RNA(mi R-145-5p)作为进一步研究对象,分析其与临床化验室指标、BVAS评分和血清细胞因子表达水平之间的相关性,绘制ROC曲线并分析,讨论其作为MPO-AAV潜在诊断标记的可能;4.体外构建脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导后的人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cell,HRGEC)炎性损伤模型,通过与HC(Healthy Control)来源的外周血血浆外泌体共培养,探索HC来源的外周血血浆外泌体对HRGEC炎性损伤后相关指标的影响;5.通过在HRGEC炎性损伤模型中改变mi R-145-5p表达水平,观察其下游炎症和焦亡等相关蛋白的表达水平是否发生变化,以及线粒体损伤相关指标的变化,并通过生物信息学预测其靶向结合的基因,探讨其发挥作用的可能潜在机制;6.构建MPO-AAV动物模型,通过AAV9-mi R145将mi R-145在模型鼠肾脏中实现过表达,进一步探索mi R-145-5p在MPO-AAV模型鼠肾血管内皮损伤中发挥的作用,验证体外实验结果。研究结果1.入选的MPO-AAV活动期患者中位年龄63.50岁,HC组中位年龄64.00岁,且两组内男女比例相当,无统计学差异。MPO-AAV活动期组患者BVAS评分为21.60±3.20分,符合病情活动判断标准。血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、肌酐(creatinine,CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)等血清学指标,组间差异明显,均具有统计学意义(P<0.0001)。24小时尿蛋白定量结果显示,MPO-AAV活动期患者24小时尿蛋白定量中位数为217.00mg,较HC组明显升高,具有统计学差异(P<0.0001)。通过应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对两组研究对象的血清细胞因子水平检测,发现MPO-AAV活动期患者血清中白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion protein-1,VCAM-1)、E-选择素(E-selectin)分泌水平均较HC组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.0001);2.透射电镜、粒径分析及Western Blot结果表明成功获取研究对象外周血血浆外泌体。血浆外泌体全转录组高通量测序结果显示,与HC组相比,共有323个mi RNAs存在不同程度的差异表达,其中上调100个,下调223个。GO及KEGG Pathway生物信息学预测结果提示这些差异表达的mi RNAs大多与炎症、免疫、肿瘤等信号通路相关;3.扩大临床样本验证结果显示,5个验证的mi RNAs(hsa-mi R-130a-3p、hsa-mi R-145-5p、hsa-mi R-181c-5p、hsa-mi R-450a-5p和hsa-mir-582-5p)表GW-572016体内实验剂量达水平趋势均与测序结果一致,据此认为该测序结果可靠。其中,mi R-145-5p在MPO-AAV活动期患者外周血血浆外泌体中相比于HC组表达水平明显下降,较其他4个mi RNAs表达水平差异更为显著,因此,选取mi R-145-5p作为本研究深入探讨的研究对象;4.MPO-AAV外周血血浆外泌体中mi R-145-5p表达水平与24小时尿蛋白定量、CRP、BUN、CRE和BVAS评分呈负相关,与血清细胞因子(IL-1β,IL-18,TNF-α,VCAM-1)呈负相关,具有统计学差异(P<0.05)。绘制ROC曲线后分析发现,其作为MPO-AAV活动期诊断标记物的敏感度为82.50%,特异度为62.50%,ROC曲线下面积为0.875;5.将HC组外周血血浆外泌体与HRGEC炎性损伤模型共培养后发现,来源于健康对照组的血浆外泌体能减轻LPS诱导的HRGEC的炎性损伤;6.在LPS诱导的HRGEC炎性损伤模型中,过表达mi R-145-5p后,其下游炎症和焦亡相关蛋白(IL-1β、IL-18、NLRP3、GSDMD、Caspase-11)下调;反之上调。生信预测发现mi R-145-5p与ADAM金属肽酶域17(metallopeptidase domain 17,ADAM17)间可能存在靶向结合关系,双荧光素酶实验证实了这种预测,并通过平行实验进一步证实了两者之间的靶向关系;7.在MPO-AAV动物模型中过表达mi R-145后,相比于AAV9-Vector组,ADAM17表达下调,其肾脏组织下游炎症和焦亡相关蛋白(IL-1β、IL-18、NLRP3、GSDMD、Caspase-11)下调,大鼠血清中IL-1β和IL-18下调。上述体外结合体内实验结果表明,mi R-145-5p能够显著改善MPO-AAV肾小球血管内皮细胞炎性损伤,其机制可能涉及mi R-145-5p通过靶向抑制ADAM17,从而影响NLRP3炎症小体通路的激活、线粒体损伤和细胞焦亡。研究结论1.MPO-AAV外周血血浆外泌体中mi RNAs表达谱有显著改变,生物信息学分析显示这些差异表达的mi RNAs可能通过干预炎症相关的信号通路参与MPO-AAV的发病;2.MPO-AAV活动期患者外周血外泌体中mi R-145-5p水平显著降低,经过关联分析后发现其与24小时尿蛋白定量、CRP、BUN、CRE、BVAS评分具有负相关性,且与患者血清中细胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、VCAM-1)具有负相关性。ROC曲线分析结果表明,外周血外泌体中mi R-145-5p表达水平可以作为MPO-AAV活动期的辅助诊断标记物;3.来源于HC外周血血浆外泌体可以改善LPS体外诱导的HRGEC炎性损伤;4.细胞和动物实验结果表明,mi R-145-5p可能通过靶向抑制ADAM17,调控NLRP3炎症小体通路,影响肾小球血管内皮细胞的线粒体损伤和焦亡,从而改善MPO-AAV肾小球血管内皮炎性损伤。