研究背景及目的:胆囊癌(Gallbladder cancer;GBC)是一种细胞具有高度异质性(Tumor heterogeneity)的肿瘤,且治疗效果及预后极差。随着免疫治疗的发展,癌症患者的治疗发生了巨大的变化,也给癌症患者的治疗及科研工作者带来了希望。目前有不少临床试验针对胆囊癌的免疫治疗,使患者可以获得临床缓解,但是能获益的患者仅占少部分。胆囊癌肿瘤微环境中细胞类型、细胞间的相互作用等都影响着免疫治疗的效果。因此解析胆囊癌肿瘤微环境,在深刻地了解肿瘤的同时,有望探索出胆囊癌潜在的治疗方向和治疗靶点。肿瘤微环境中每个细胞亚群都具有不同功能,CD8~+T细胞可以在识别新抗原后直接识别并杀死癌细胞,CD4~+T细胞也可以协调各种免疫反应,增强或抑制对癌细胞的免疫。树突状细胞(Dendritic cells;DCs)通过呈递肿瘤抗原、分泌促炎和抗炎细胞因子和趋化因子,来启动和调节针对肿瘤的先天和适应性免疫反应。巨噬细胞可以通过刺激血管生成、促进炎症和抑制抗肿瘤免疫来促进癌症的发生、进展甚至转移。内皮细胞可以促进血管生成和淋巴管生成,从而促进肿瘤远处转移。此外,这些免疫细胞间还存在着频繁的、诸如配体-受体等互作关系,达到免疫抑制或者增强免疫作用。目前相关研究进展揭示,肿瘤微环境中CD8~+T细胞普遍具有耗竭性现象,而效应CD8~+T细胞接受抗原刺激后也可转变为耗竭性CD8~+T细胞;CD4~+T细胞中的大多数亚型具有免疫抑制作用;巨噬细胞的主要作用是免疫抑制和促进肿瘤生长。近年来多项研究通过解析肿瘤微环境中不同免疫细胞的作用,已陆续发现新的、潜在的肿瘤治疗靶点。近年来,单细胞测序技术为我们在解析肿瘤微环境提供了强有力的工具,可获得单个细胞及其组合的表观基因组学、基因组学、转录组学和蛋白质组学特征等多层信息,从而充分了解肿瘤微环境中的肿瘤细胞类型、免疫细胞的各种亚型、不同细胞的差异基因、细胞之间相关作用及转化等。进而不断找出新的基因靶点,以及基于基因层面的生物标记物。随着单细胞测序技术的发展,单细胞转录测序(single-cell RNA sequencing;scRNA-seq)和单细胞染色质转座酶可及性测序(single-cell Assay for Transposase-AccBio-inspired computingessible Chromatin with highthroughput sequencing;sc ATAC-seq)受到广大关注。scRNA-seq可以提供单细胞转录组学的信息,了解单个细胞的基因表达状态、即细胞的转录状态。而sc ATAC-seq可以揭示细胞转录相关调控的基因景观。将scRNA-seq与sc ATAC-seq联合分析能够将基因表达与调控元件的可及性联系起来selleck合成,能够更准确地重建细胞生理学基础的分子过程。本课题组前期通过scRNA-seq对胆囊癌进行研究,解析了肿瘤微环境中的细胞异质性和相互作用,发现微环境中免疫细胞普遍具有免疫抑制,但基于sc ATAC-seq、关于胆囊癌细胞转录相关调控基因景观的研究尚存在空白,因此采用sc ATAC-seq和scRNA-seq联合分析方案,将为全面揭示胆囊癌微环境和异质性、以及发现新型精准治疗靶点,提供充分的科学依据。研究方法:本研究从入组的胆囊腺癌患者获取胆囊原发肿瘤及肿瘤旁组织进行分析。测序方法选择10X Genomics公司提供的Tn5转座酶测序和单细胞转录组测序。然后使用Harmony、Signac、Seurat、Monocle、Cicero、Cellchat等算法对胆囊癌微环境进行分群、功能富集,探索细胞间转化关系及不同细胞亚群之间的相互作用。研究结果:1、通过scRNA-seq获得了40129个细胞,通过sc ATAC-seq获得了13844个细胞,从中鉴定出8个细胞群,包括上皮细胞、T&NK细胞、B细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞和肥大细胞。2、T&NK细胞鉴定出12个亚群,其中CXCL13~+CD4~+T细胞、FOXP3~+CD4~+T细胞和GZMB~+CD8~+T细胞在胆囊癌组织中具有较强的免疫抑制作用,其高表达的免疫抑制基因(HAVCR2、LAG3、PDCD1、TIGIT)可能是胆囊癌潜在的治疗靶点;此外,细胞毒性GZMK~+CD8~+T细胞在胆囊癌中可转变为GZMB~+CD8~+T细胞,体现出胆囊癌中T细胞普遍存在免疫抑制表现。髓系细胞鉴定出11个亚群,巨噬细胞在胆RSL3研究购买囊癌中主要进行M2极化且M2型巨噬细胞占大多数,提示肿瘤相关巨噬细胞在胆囊癌中的免疫抑制和促癌作用;LAMP3~+树突状细胞在肿瘤微环境中具有多种功能。内皮细胞鉴定出2个亚群,主要参与血管生成和淋巴管生成,在促进胆囊癌远处转移中可能起着重要作用。上皮细胞鉴定出4个亚群,发现Epi＿C4作为肿瘤中特异性的细胞,高表达MHC I类和MHC II类分子,且在多方面的功能上具有重要作用。3、成纤维细胞、内皮细胞与众多细胞之间存在广泛的细胞通信,其中与肿瘤上皮细胞间的交流尤为活跃;此外,成纤维细胞与肿瘤上皮细胞、巨噬细胞与T细胞、及肿瘤上皮细胞与T细胞之间,通过配体-受体结合形成了密切的互作关系。结论:本研究鉴定出胆囊癌中存在8个特征细胞群及其亚群,阐明了微环境各类型细胞间存在的相互作用关系,相关研究结果为靶向或免疫治疗胆囊癌提供了潜在的干预靶点。