高血压肾病(hypertensive nephropathy,HN)已成为全球慢性肾病(CKD)死亡的第二大原因,目前用于预防或延缓肾功能恶化的药物仍然很少。高血压肾病是长期高血压状态,引起肾内小动脉及细小动脉病变,导致动脉管腔的狭窄,继发缺血性肾实质损害,并造成肾小球硬化,小管萎缩及间质纤维化。高血压肾病的发病机制复杂,已报道多种因素参与了高血压肾病的发生进展,如肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)的激活;内皮功能障碍;氧化应激;免疫系统的激活,等等。目前治疗高血压肾病的药物主要包括,血管紧张素受体阻滞剂(ARB)和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI),直接肾素抑制剂(阿利吉伦),醛固酮受体拮抗剂(MRA),利尿剂,钙通道阻滞剂(CCB),β受体阻滞剂,α受体阻滞剂。还有一些药物具有一定降压作用并对肾脏有保护作用,包括钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose co-transporter 2,SGLT2)抑制剂和血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor neprilysin inhibitor,ARNI)。研究表明经SGLT2抑制剂干预治疗,即使初始治疗阶段可能会短暂降低估算的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,e GFR),但长期干预均有肾脏和心血管的获益。其他治疗干预措施包括,控制血压,以及控制体质量及合理饮食、科学运动等生活方式管理。然而,高血压肾病目前的治疗方法只能延缓,不能逆转或阻止疾病的进展。为进一步探索高血压肾损害可能的机制及卡格列净(Cana)的作用机制,我们用8%高盐喂养Dahl盐敏感(Dahl salt-sensitive,Dahl SS)大鼠诱导高血压肾损害,并同时予Cana干预治疗12周,观察Cana对大鼠血压及肾损害的影响,探索该药发挥肾脏保护作用可能的机制。同时比较了Cana与厄贝沙坦(Irb)的降压及肾脏保护作用。此外,补体系统异常激活也被认为是高血压肾损害发生发展的危险因素。我们收集原发性高血压伴肾功能损害的临床病例资料来进一步探索补体在高血压肾损害发生发展中的作用,为高血压肾病的临床诊治提供新靶点。第一部分高血压肾损害模型的建立和评价目的:8%高盐诱导Dahl SS大鼠12周,建立高血压慢性肾损害模型,同时给予Cana,Irb及Cana+Irb药物干预,并评价三组药物干预的效果。方法:1.30只6-7周龄Dahl SS雄性大鼠,自由饮食,食物为Ain-76a纯化啮齿动物饲料(0.3%氯化钠)进行10天适应性喂养,随后分为5组,每组6只大鼠,组1为对照组(Con):0.3%低盐饮食(low-salt diet),并给予0.5%羟丙基甲基纤维素(药物溶剂)灌胃,作为空白对照组;组2为高盐喂养组(HSD):用8%高盐饮食(high-salt diet,HSD)喂养建立高血压肾损害模型,并给予0.5%羟丙基甲基纤维素(药物溶剂)灌胃,不给予任何药物干预;组3(HSD+Cana):8%HSD同时联合Cana 30mg/kg/d灌胃干预治疗组;组4(HSD+Irb):8%HSD同时联合厄贝沙坦30mg/kg/d灌胃干预治疗组;组5(HSD+Cana+Irb):8%HSD同时联合卡格列净30mg/kg/d及厄贝沙坦30mg/kg/d灌胃干预治疗组。2.喂养Dahl SS大鼠12周,并监测大鼠的精神状态、外貌体征等一般情况及血压、体重、24 h进水量、24h进食量、24 h尿量。3.腹主动脉取血,收集大鼠血清,使用自动生化分析仪检测血清中肌酐、尿素氮、尿酸、血糖、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血钠。收集大鼠随机尿,检测尿糖、尿钠。4.使用商业试剂盒测定随机尿中胱氨酸抑素C(Cyc-C)、肾损伤分子-1(KIM-1)、和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的含量。5.分别进行H&E、PAS、Masson染色,分析五组大鼠肾小球及肾小管受损情况和肾脏纤维化面积。结果:1.与对照组相比,HSD组收缩压(SBP)明显升高。在给予Cana、Irb或Cana+Irb后,HSD+Cana组、HSD+Irb组和HSD+Cana+Irb组大鼠的收缩压较HSD组明显下降。HSD+Cana+Irb组降低收缩压的效果明显优于HSD+Cana组和HSD+Irb组。HSD+Cana组和HSD+Irb组在降低收缩压方面无统计学差异。2.与对照组相比,HSD组舒张压(DBP)明显升高。在给予Cana、Irb或Cana+Irb后,HSD+Cana组、HSD+Irb组和HSD+Cana+Irb组大鼠的舒张压较HSD组明显下降。在接受相应药物治疗的第3周,HSD+Cana+Irb组降低DBP的效果明显优于HSD+Cana组和HSD+Irb组。但第6周开始,HSD+Cana组、HSD+Irb组和HSD+Cana+Irb组降低舒张压效果上无差异。3.HSD组和药物干预组(HSD+Cana、HSD+Irb、HSD+Cana+Irb)大鼠较对照组大鼠摄入了更多的水,进而相应的尿量也增加,尤其在HSD+Cana组和HSD+Cana+Irb组摄入水量和尿量增多的更为明显。与HSD组相比,HSD+Cana组和HSD+Cana+Irb组的食物摄入量明显增加,体重却明显下降。4.8%高盐喂养12周,我们发现HSD组大鼠尿蛋白/尿肌酐明显高于对照组,但在Cana联合Irb干预后,尿蛋白/尿肌酐明显低于HSD组。同样,HSD组大鼠尿Cyc-C、KIM-1、和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的含量较对照组明显升高,Cana单药干预和与Irb联合干预均显著降低尿Cyc-C、KIM-1和NGAL水平。HSD组尿钠排泄量明显高于对照组,Cana单药干预和与Irb联合干预均显著降低了尿钠排泄。HSD+Cana+Irb组和HSD+Cana组尿葡萄糖排泄量明显高于对照组和HSD组,且HSD+Cana+Irb组尿葡萄糖排泄量显著高于HSD+Cana组。与对照组相比,HSD组肾脏重量显著增加,Cana+Irb联合干预组可显著降低HSD大鼠的肾脏重量。此外,各组间血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C、血清白蛋白、血清钠、谷丙转氨酶、谷草转氨酶均无显著差异。5.对照组苏木精和伊红(H&E)染色显示肾脏组织正常。而在HSD组,观察到明显的肾小球萎缩,管状颗粒变性。与对照组比较,PAS染色显示HSD组肾小球系膜基质和基底膜均有明显的细胞增殖和浸润;肾小管蛋白质管型;玻璃样变性。此外,与对照组相比,Masson三色染色发现HSD组肾脏的肾小球和小管间质纤维化显著增加。而HSD+Cana组、HSD+Irb组和HSD+Cana+Irb组细胞增殖及肾小球系膜基质和基底膜浸润显著减少;肾小球萎缩、肾小管肿胀显著改善;肾间质纤维化面积显著减少。HSD+Cana组、HSD+Irb组和HSD+CaTaurine分子量na+Irb组在肾脏保护作用方面无统计学差异。小结:1.8%高盐诱导Dahl SS大鼠12周,建立高血压肾损害模型。2.Cana联合Irb较Cana或Irb单药干预降低收缩压的效果更显著。接受相应药物干预的第3周,Cana联合Irb降低舒张压的效果显著优于Cana或Irb单药干预,但随着药物干预时间的延长,Cana联合Irb,Cana或Irb单药干预降低舒张压效果相当,无统计学差异。3.Cana干预治疗可降低血压,同时还具有减轻体重、利尿的作用,但不影响大鼠正常的血糖、血钠水平。4.8%高盐诱导Dahl SS大鼠12周后,大鼠出现高血压肾损害及肾纤维化,而Cana可以改善上述改变。第二部分卡格列净对Dahl盐敏感大鼠肾脏上皮间充质转变(EMT)及氧化应激的影响目的:观察8%高盐饲料喂养Dahl SS大鼠12周后肾脏EMT及氧化应激相关指标的改变,并进一步分析及比较Cana,Irb,Cana联合Irb对Dahl SS大鼠肾脏EMT及氧化应激的影响。方法:1.用Western Blotting检测肾脏组织中SIRT3,上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(vimentin),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平。2.用免疫组化染色进一步检测肾脏组织中SIRT3,E-cadhKD025erin,vimentin,α-SMA的蛋白表达。3.肾脏皮质中MDA,GSH含量用商业试剂盒采用除蛋白法测定。结果:1.Western Blotting、免疫组化结果显示HSD组大鼠肾脏中SIRT3,E-cadherin蛋白表达显著减少,vimentin及α-SMA蛋白表达显著增加,经Cana,Irb及Cana联合Irb干预12周后SIRT3、E-cadherin蛋白表达显著增加,vimentin及α-SMA蛋白表达显著减少,且有统计学差异。三组药物干预,对SIRT3、E-cadherin、α-SMA的蛋白表达的改善效果无统计学差异,但Cana联合Irb干预对vimentin的蛋白表达的改善效果显著优于Cana及Irb干预组。2.HSD组大鼠肾脏MDA水平较对照组显著升高,而GSH水平较对照组显著降低,Cana、Irb及Cana联合Irb干预12周后MDA较HSD组显著降低,GSH显著升高,有统计学差异。三组药物干预效果无统计学差异。在HSD组肾脏中catalase蛋白表达水平较对照组显著降低,Cana、Irb及Cana联合Irb干预12周后较HSD显著升高,有统计学差异。三组药物干预效果无统计学差异。小结:1.EMT是肾脏纤维化的重要组成成分,表现为E-cadherin表达减少,vimentin及α-SMA表达增加。经8%高盐饲料喂养12周后的Dahl SS大鼠发生了EMT,Cana、Irb及Cana联合Irb干预均可通过减少EMT来改善肾脏损害。2.经8%高盐饲料喂养12周后的Dahl SS大鼠肾脏氧化应激指标MDA水平显著升高,而GSH水平显著降低,catalase蛋白表达显著降低;Cana、Irb及Cana联合Irb干预均可通过减少氧化应激来改善肾脏损害,三组药物干预效果无统计学差异。第三部分SIRT3介导了卡格列净对AngⅡ诱导的HK-2上皮间充质转化目的:评价Cana药物干预对细胞的安全性,探讨Cana对Ang-Ⅱ诱导HK-2的EMT的影响及机制。方法:1.HK-2以6×10~4 cells/well的密度接种于96孔板上,通过CCK-8筛选Ang-Ⅱ的浓度。2.通过CCK-8筛选Cana的浓度。3.合成siRNA-SIRT3,用q RT-PCR及Western Blotting检验SIRT3基因沉默成功与否。4.实验分为7组:Con(空白对照组)、AngⅡ组、AngⅡ+Cana 25、AngⅡ+siRNA SIRT3、AngⅡ+si-NC、AngⅡ+Cana25+siRNA SIRT3和AngⅡ+Cana25+si-NC组。5.各组细胞培养24h后,收集细胞,Western Blotting检测细胞中SIRT3、FOXO3a、catalase、E-cadherin、vimentin、α-SMA的蛋白表达水平。结果:1.HK-2以6×10~4 cells/well的密度接种于96孔板上,Ang-Ⅱ的浓度分别设定为10~(-8)M、10~(-7)M、10~(-6)M、10~(-5)M,通过CCK-8筛选Ang-Ⅱ的最佳浓度,最终选择10~(-6)M。2.HK-2以6×10~4 cells/well的密度接种于96孔板上,将Cana的浓度分别以5、10、15、20、25、30μM加入Ang-Ⅱ浓度为10~(-6)M的细胞培养基中,通过CCK-8筛选Cana的最佳浓度,最终选择25μM,此浓度即无细胞毒性,又发挥药物活性作用。3.siRNA转染HK-2细胞后,与si-NC对照组相比,si-SIRT3-1组和si-SIRT3-2组的SIRT3的m RNA和蛋白表达显著降低,si-SIRT3-1组与si-SIRT3-2组比较差异无统计学意义。4.Western Blotting结果显示与AngⅡ组相比,AngⅡ+Cana25组的SIRT3、FOXO3a、catalase、E-cadherin蛋白表达水平均显著升高而vimentin、α-SMA的蛋白表达水平均显著降低,且均有统计学差异。5.SIRT3基因沉默后,AngⅡ+Cana25+siRNA SIRT3组的SIRT3、FOXO3a、catalase、E-cadherin蛋白表达较AngⅡ+Cana25+si-NC组及AngⅡ+Cana25组明显减少,均有统计学差异。AngⅡ+Cana25+siRNA SIRT3组vimentin和α-SMA蛋白表达较AngⅡ+Cana25+si-NC组及AngⅡ+Cana25明显增加,均有统计学差异。小结:1.Western Blotting结果显示与AngⅡ组相比,Cana干预后SIRT3、FOXO3a、catalase、E-cadherin蛋白表达水平均显著升高及vimentin、α-SMA的蛋白表达水平均显著降低,且均有统计学差异。2.SIRT3基因沉默后,Cana干预后E-cadherin蛋白的增加在很大程度上被SIRT3的沉默而减弱,而vimentin和α-SMA蛋白的减少则被SIRT3的沉默显著消除。结果表明,Cana可能通过SIRT3依赖的途径抑制AngⅡ诱导的HK-2细胞EMT。3.SIRT3基因沉默后,Cana干预后FOXO3a,catalase蛋白的增加在很大程度上被SIRT3的沉默而减弱。结果提示,Cana可能通过SIRT3依赖的途径抑制AngⅡ诱导的HK-2细胞氧化应激。第四部分血清补体活化与高血压肾损害相关性研究目的:探讨补体C3,补体旁路途径活性(AP50)及补体调节因子H(CFH)在原发性高血压及高血压合并肾损害患者中的表达水平与高血压肾损害的相关性。方法:1.选取2022年5月至2023年12月在河北省人民医院慢性病体检和健康体检的183例受检者,其中包括健康人群、原发性高血压且不合并肾脏损害(e GFR≥90 ml/min/1.73 m~2)及原发性高血压合并肾脏损害(e GFR<60 ml/min/1.73 m~2)的患者。对所有纳入受试者进行一般临床情况采集,包括:身高、体重、年龄、性别、既往慢性病史、临床用药情况、吸烟史、饮酒史、血压情况、肾脏超声及临床相关化验指标。2.依据纳入标准分为:原发性高血合并肾脏损害(RD)组、原发性高血压无肾脏损害(NRD)组及健康对照组(Normal),收集受试者血清样本,测定血清中补体成分C3、补体系统的旁路途径活性(AP50)及补体调节因子H(CFH)含量。3.采用SPSS 25.0软件进行数据分析,正态分布的计量资料用(均数±标准差)表示,多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料用中位数(四分位数间距)[M(Q1,Q3)]表示,多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。计数资料以频数和百分率表示,采用χ~2检验和Fisher精确概率法。分析C3、AP50、CFH与高血压肾损害指标的相关性采用Spearman相关性分析。多因素logistic回归分析与高血压及高血压肾损害相关的影响因素。以P<0.05时视为差异有统计学意义。结果:1.三组受试者在性别、年龄、身高、吸烟史、饮酒史均无统计学差异。NRD组与健康对照组间e GFR无显著差异。年龄、性别、身高、吸烟史、饮酒史、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。NRD组与RD组两组e GFR有显著差异(P<0.001),收缩压和舒张压差异无统计学意义(分别为P<0.001,P=0.002)。2.三组间年龄、性别、身高、吸烟史、饮酒史、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。健康对照组血清C3水平为(152.15±17.80)mg/d L,NRD组为(166.71±21.31)mg/d L,RD组为(178.52±18.82)mg/d L,各组间差异有统计学意义(均P<0.05),AP50分别为18.27(17.16,19.03)U/ml、19.20(18.59,20.50)U/ml、20.97(20.22,22.14)U/ml,三组之间存在统计学差异(均P<0.05)。CFH分别为319.36(292.69,353.07)μg/L、269.23(239.43,292.21)μg/LMining remediation、239.78(212.93,255.50)μg/L,三组之间均存在统计学差异(均P<0.05)。3.Spearman相关性分析:血清补体C3、AP50分别与e GFR呈显著负相关,血清补体CFH与e GFR呈显著正相关,血清补体C3、AP50与血清肌酐呈显著正相关,血清补体CFH与血清肌酐呈负相关。4.分别以健康人群是否发生高血压为因变量,进行二元logistic回归分析,结果显示血清C3增加、CFH减少及SBP升高是高血压的独立危险因素;以高血压患者是否发生高血压肾损害为因变量,进行二元logistic回归分析,显示AP的激活、CFH的减少及BMI增加是高血压向高血压肾损害进展的独立危险因素;以健康人群是否发生高血压肾损害为因变量,进行二元logistic回归分析,结果显示血清C3增加、AP激活、CFH减少及SBP升高是高血压肾损害的独立危险因素。小结:补体激活、特别是补体旁路的异常激活,可能是高血压肾损害发生发展的重要危险因素之一。