背景:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate DehydGefitinib-based PROTAC 3细胞培养rogenase,G6PD)是由管家X链基因编码一种的胞浆酶,它是磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway,PPP)的关键酶,可以生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,从而保持细胞内适当的还原环境,在红细胞中尤为重要,因此G6PD的功能障碍可以导致红细胞应对氧化应激的能力下降。这种功能障碍是由多种突变引起的,其中最常见的是单核苷酸替换,其次是多个突变、缺失和内含子突变。G6PD缺乏症是一种在生活中较为常见的血液系统方面的基因遗传病,由管家基因G6PD的有害突变引起的X连锁隐性遗传病,全球估计有5亿人受累,临床表现从无症状到急性溶血等差异大,截止到今天G6PD缺乏症尚无根治方法。目前根据G6PD的生物化学和物理化学特性,已有400多个基因突变位点在G6PD缺乏症中被描述。让我们对这种疾病有一个完整的认识,有助于及时发现和治疗并可为该病的产前诊断提供必要的信息。目的:(1)对一蚕豆病遗传家系的G6PD基因突变进行分析;(2)并对先证者家系进行X染色体失活(XCI)偏移模式检测,从而预测G6PD突变女性携带者患蚕豆病的风险。方法:(1)取家系所有成员的外周血储存于含有EDTA-K_2的抗凝管中并提取家系内所有成员的基因组DNA,用聚合酶链式反应(PCR)和DNA测序法进行序列分析,确定先证者突变位点和突变类型;(2)根据突变结果,结合生物信息学分析其突变确定其突变危害及突变对G6PD蛋白结果稳定性的影响;(3)根据突变结果,利用PCR介导的定点突变方法将含有野生型(WT)及突变型(MUT)的基因片段和表达载体结合后,将其转染至HEK293T细胞,并应用ELISA、QPCR、Western B lot等方法,来分别检测G6PD酶活性、m RNA与蛋白的相对表达量;(4)在确认先证者母亲和姐姐均为G6PD突变携带者以后,对家系成员进行X染色体偏移检测,以评估携带者患蚕豆病的风险。结果:对先证者男童进行基因检测,确定其三个突变位点,其中对蛋白质序列产生改变的为c.1376G>T,p.Arg459Leu,此位点属于错义突变。生物信息学保守性分析,Poly Phen-2、PROVEAN、Mutation Taster和Align GVGD软件进行危害性预测结果显示该突变位点具有高度保守性,且对生物体有危害。Imutant2.0、AUTO-MUTE及Py MOLWin软件breathing meditation进行蛋白质结构及稳定性预测,表明该突变位点会造成蛋白质的结构稳定性下降,第459位的Arg突变为Leu可导MLN4924溶解度致氨基酸残基的侧链与第455位的SER中间的氢键发生断裂。c.1376G>T突变位点可能具有使生物体发生G6PD缺乏症的致病性,但其功能需要进一步的实验进行验证。利用PCR和Sanger测序方法,成功构建c.1376G>T纯合突变细胞株,酶活性检测结果显示该突变使G6PD酶活性下降大约25%,m RNA和蛋白水平几乎无变化。对家系进行基因检测显示,母亲与姐姐均为携带者,XCI检测结果显示母亲的染色体失活比例为73.52%,姐姐为55.24%,X染色体失活偏移的标准为X染色体失活率≥80%,则母亲和姐姐视为无X染色体失活偏移。结论:先证者发生了X染色体G6PD-Canton热点突变导致G6PD酶活性下降从而导致蚕豆病的发生,酶活性变化不一定影响m RNA水平和蛋白水平;该家系的两位女性携带者X染色体失活偏移<80%,将来出现蚕豆病的可能性较低。