在自然条件下,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)偏好性侵染树皮组织,但人工接种也可侵染叶片组织。Micro RNA(mi RNA)是一类长度在18 nt～25 nt的非编码RNA分子,通常在转录或转录后水平调控靶标基因的表达参与生物生长发育、生物和非生物胁迫应答等多种生理过程。课题组前期研究发现micro-like RNA(milRNA)在V.mali的侵染致病中发挥重要作用,然而milRNA是否参与V.mali的组织特异性互作尚不清楚。因此本研究首先通过深度测序和生信分析鉴定V.mali在离体培养菌丝时期及侵染苹果叶片和树皮两种组织的milRNAs,分析其差异表达情况。进而对差异表达milRNAs进行功能研究。通过遗传转化法创制候选milRNAs的不同突变株,评价突变株在侵染不同组织时期的致病表型;利用生物信息学分析及分子生物学技术鉴定候选milRNAs的靶标基因,并通过遗传转化法创制medical audit靶标基因敲除突变体,评价敲除突变体侵染不同组织的致病表型,从而揭示milRNAs在病原菌组织特异性互作中的功能。本论文取得的主要研究结果如下:1.鉴定并筛选出组织特异性互作相关的候选milRNAs。构建了V.mali离体培养菌丝体(MVm)、病菌侵染叶片组织样品(ILVm)和病菌侵染树皮组织样品(IBVm)共3个milRNA文库,共鉴定出42个novel milRNAs。以菌丝时期的样本为参照,对不同样品milRNAs的差异表达分析发现Etoposide供应商,共有4个milRNAs在侵染时期共同上调表达,6个milRNAs在侵染时期共同下调表达。其中,有1个milRNAs在侵染叶片阶段特异性上调表达,有5个milRNAs在侵染枝条阶段特异性下调表达。2.发现Vm-milRN7通过调控内源靶标基因Vm-09496参与叶片组织特异性互作过程。通过遗传转化法创制了Vm-milRN7前体过表达转化株和敲除突变体,并进行了表型评价。结果表明,与野生型菌株相比,Vm-milRN7前体过表达转化株对叶片的致病力显著上升,而对枝条的致病力无明显变化;Vm-milRN7敲除突变体对苹果不同组织的致病力均显著降低。说明Vm-milRN7对病原菌的致病力有关键作用,且能促进病原菌对叶片组织的侵染。通过q RT-PCR分析筛选出符合Vm-milRN7相异表达趋势的靶标基因Vm-09496。进而,在生信分析的基础上,通过烟草共转化实验明确了Vm09496与Vm-milRN7存在靶向调控关系。在此基础上,通过遗传转化法创制了靶标基因敲除突变体,并对突变体表型进行测定。实验结果表明,与野生型菌株相比,ΔVm09496菌丝生长速率和对不同组织的致病力显著提高。说明Vm-09496对病原菌的致病力起负调控作用。3.发现Vm-milR21在V.mali对树皮组织特异性互作中发挥重要作用,其靶标基因Vm-03494正向调控病原菌的致病力。通过遗传转化法创制了Vm-milR21前体过表达转化株和沉默转化株并对其进行表型评价。结果表明,与野生型菌株相比,VmmilR21前体过表达转化株在菌丝生长速GDC-0973率以及对叶片和枝条的致病力大幅降低,且在枝条上致病力降低更为显著;Vm-milR21沉默转化株对苹果不同组织的病力无明显变化。进而通过q RT-PCR和烟草共转化实验明确了Vm-milR21与Vm-03494之间的靶向调控关系。在此基础上对Vm-03494进行敲除,表型评价发现,与野生型菌株相比,ΔVm-03494菌丝生长速率和对不同组织的致病力显著降低。说明Vm-03494在病原菌侵染时期发挥重要作用。