胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是恶性级别最高的胶质瘤,占胶质瘤发生率的50%以上。由于GBM肿瘤细胞具有高度异质性,常常表现为弥漫性浸润性生长,并且肿瘤内血管化严重,外科手术做到肿瘤完全切除难度较大,而且GBM对现有放化疗的耐受性高,多种联合治疗方案对GBM疗效较差。因此,探索GBM新的治疗方法,特别是靶向治疗尤为重要。铁是细胞存活和代谢的重要微量元素,参与遗传物质合成、线粒体生物合成、能量代谢和氧气运输等生物过程。研究表明,在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中铁的含量及铁代谢相关蛋白发生infections in IBD改变。例如,在乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌中铁输出蛋白(ferroportin,FPN)的表达降低,它能引起不稳定铁池水平增加,促进肿瘤生长。而细胞中的铁超载,引起铁离子及含铁酶催化的细胞脂质过氧化物的代谢异常增强,导致细胞氧化还原失衡,大量脂质过氧化产物堆积,造成细胞氧化应激和铁死亡等细胞损伤。p53作为一种抑癌因子,可以诱导由细胞损伤或生理环境导致的生长停滞或细胞凋亡,包括维持基因组的稳定性、调节细胞代谢和肿瘤微环境。研究表明,p53通GSK1349572细胞培养过调节铁代谢相关蛋白来调节铁稳态,一些铁调节相关蛋白(如铁调节蛋白、铁转运蛋白等)还与p53形成反馈调节回路。同时,p53通过对溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11,也称x CT)的转录过程发挥抑制作用,并抑制胱氨酸/谷氨酸转运系统(system x_c~-),抑制谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达,从而增强细胞对铁死亡的敏感性。因此,p53和铁代谢相关蛋白及铁死亡之间的相互作用可能为揭示癌症中铁代谢Berzosertib分子式改变的机制提供新的思路。综上所述,研究p53对GBM中铁代谢的作用可以为GBM的发病机制提供新的研究思路,并可能为开发GBM新的靶向治疗方法产生重要作用。但目前针对p53在GBM铁代谢及铁死亡过程中发挥的作用尚不明确,需要进一步探索。为探究p53对GBM铁代谢及铁死亡的作用及相关机制。本实验选择了两株GBM细胞系——U87(p53野生型)和U251(p53突变型)细胞,通过细胞培养进行铁代谢及铁死亡相关研究。通过铁检测试剂盒(Iron Assay Kit)测定细胞中的铁含量水平;通过Western Blotting检测铁代谢相关蛋白,包括二价金属转运体(divalent metal transporter 1,DMT1)、转铁蛋白受体(transferrin receptor 1,Tf R1)、铁调节蛋白1(iron regulatory protein 1,IRP1)、铁调节蛋白2(iron regulatory protein 2,IRP2)、重链铁蛋白(ferritin heavy chain,FTH)、FPN及铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4等是否存在差异;通过实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞铁代谢相关基因m RNA表达水平并进行定量分析和差异比较;通过CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒检测细胞存活率;通过流式细胞术检测Erastin处理后两组细胞的脂质过氧化水平;通过透射电子显微镜观察不同处理后细胞形态的改变;通过CRISPER-Cas9技术将U87细胞TP53基因敲除,进行铁代谢及铁死亡蛋白的检测。从两株细胞中铁代谢及铁死亡相关基因及蛋白表达的差异,并结合前述两株细胞不同p53类型的差异,明确p53在GBM细胞系铁代谢及铁死亡中发挥的作用。实验研究结果如下:1.Western Blotting结果显示,与U87细胞相比,U251细胞p53蛋白表达水平降低55.5%,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.通过Iron Assay Kit对U87及U251细胞进行铁含量测定,结果显示,U251细胞比U87细胞的铁含量高21.6%,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.RT-PCR结果显示,与U87细胞相比,U251细胞在IRP1、IRP2、FPN、DMT1和Tf R1的m RNA表达水平分别降低46.49%、58.29%、92.88%、29.16%和23.04%,差异具有统计学意义(P<0.01),而FTH的m RNA表达在两种细胞之间没有明显差异(P>0.05)。4.Western Blotting结果显示,与U87细胞相比,U251细胞中FTH蛋白含量降低59.49%,Tf R1蛋白含量升高23.17%,IRP2蛋白含量降低40.80%,差异具有统计学意义(P<0.05),而IRP1、DMT1、FPN蛋白含量无明显差异(P>0.05)。5.Erastin处理24 hrs后,与U87细胞相比,U251细胞存活率降低16.80%,差异具有统计学意义(P<0.05)。对Erastin处理后24 hrs、48 hrs、72 hrs、96 hrs、120 hrs的两种细胞进行细胞存活率检测,结果显示,与对照组相比,U87组细胞存活率下降10.72%、37.67%、49.64%、57.63%、55.55%,U251组细胞存活率下降10.33%、29.91%、54.36%、68.92%、86.38%;与DMSO组相比,U87组存活率下降11.40%、34.93%、48.72%、56.69%、56.07,U251组存活率下降8.97%、29.17%、54.55%、70.02%、86.11%,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.Erastin处理24 hrs后,U87细胞GPX4蛋白表达较对照组及DMSO组相比分别下降35.73%和37.09%,U251细胞GPX4蛋白表达分别下降40.04%和45.06%,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。7.BODIPY C11染色流式细胞术对细胞脂质过氧化水平进行测定,结果显示,经Erastin处理24 hrs后U87细胞中脂质过氧化水平较对照组与DMSO组分别升高34.12%和25.40%,差异具有统计学意义(P<0.01),U251细胞中分别升高34.01%和31.38%,差异具有统计学意义(P<0.001)。8.透射电子显微镜结果显示,在U87及U251两组细胞中,与对照组及DMSO组相比Erastin处理组细胞形态均出现明显改变,细胞中线粒体空泡明显增多,线粒体膜密度增加,线粒体嵴结构减少,细胞核皱缩。9.利用CRISPER-Cas9技术将U87细胞TP53敲除后,Western Blotting测定铁代谢及铁死亡相关蛋白表达,结果显示,与阴性对照组U87-NC细胞相比,敲除后U87-TP53 KO细胞中GPX4及FTH表达水平分别降低39.64%及21.01%,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。综上所述,p53的不同状态可以对GBM细胞系U87及U251细胞铁代谢相关基因及蛋白表达产生不同作用,并且铁代谢相关蛋白的表达可能存在转录后修饰等过程。p53突变会引起GBM细胞对铁死亡的敏感性增强,这种敏感性增强的效应可能是通过对GPX4的表达抑制产生的。本研究为阐明p53在GBM铁代谢及铁死亡中发挥的作用具有重要意义,为GBM的靶向治疗提供了新思路。