铜是具有氧化还原活性的过渡金属,从细菌到哺乳动物,铜在调控需氧生物抗氧化机制、能量稳态、信号网络和细胞代谢中发挥重要作用。本研究综合运用代谢组学、蛋白质组学及其他分子生物学技术手段,研究铜对獭兔毛囊发育和真皮乳头细胞代谢的影响。研究内容如下:1.日粮添加铜对獭兔生长性能和毛囊发育的影响选取160只体重相近健康状况良好的90日龄獭兔,随机分为4组,每组40个重复,每个重复1只。试验獭兔单笼饲养。对照组:饲喂基础日粮(铜含量实测值为8.4mg/kg),铜处理组:基础日粮中分别加入30、60和120 mg/kg铜(其中,铜含量的实测值分别为39.1、67.5和127.7 mg/kg)。试验持续42 d(预试7 d,正式试验共35d)。试验结果表明:基础日粮中添加30 mg/kg铜显著提高了平均日增重(P<0.05)和平均日采食量(P<0.05),但对料重比、全净膛率和半净膛率无显著影响(P>0.05);基础日粮中添加铜显著提高了獭兔血浆铜(P<0.05)和血清铜蓝蛋白含量(P<0.05),对血清谷丙转氨酶(P>0.05)和谷草转氨酶(P>0.05)活性无显著影响;日粮添加铜显著提高了獭兔毛囊密度(P<0.05)和次级毛囊与初级毛囊的比值(P<0.05),但对毛皮面积(P>0.05)、毛皮重量(P>0.05)、毛皮厚度(P>0.05)和被毛长度(P>0.05)均无显著影响。此外,铜显著上调了獭兔背皮中碱性磷酸酶(ALPL)、角蛋白关联蛋白基因3.1(KAP3.1)和角蛋白关联蛋白基因6.1(KAP6.1)基因表达,显著下调转化生长因子β2(TGFβ-2)基因表达和磷酸化m TOR相关调控蛋白(Phosphorylation-regulatory associated protein of m TOR,p-Raptor)和磷酸化AMP激活蛋白激酶(Phosphorylation-AMP-activated protein kinase,p-AMPK)蛋白表达水平,显著提高了獭兔背皮中磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶1(Phosphorylation-Ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)蛋白表达水平。2.铜对獭兔真皮乳头细胞增殖的影响将獭兔真皮乳头细胞分为对照组和铜处理组。对照组:无血清培养基中不添加铜;铜处理组:无血清培养基中分别添加0、0.2、0.5、0.75、1、2、5、10、100和1,000 nM的铜。处理獭兔真皮乳头细胞24 h,观察铜对真皮乳头细胞增殖的影响。试验结果表明,培养基中添加1 nM铜显著促进了真皮乳头细胞增殖(P<0.05),并显著提高线粒体细胞色素c核心亚基I(Mitochondrially encoded cytochrome c oxidase I,MTCO1)蛋白表达(P<0.05)、细胞色素c氧化酶活性(P<0.05)和ATP产生(P<0.05)。此外,基于非靶代谢组学研究铜对真皮乳头细胞代谢的影响,结果表明,差异代谢物被显著富集到花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、组氨酸代谢和丙氨酸(Histidine and alanine metabolism)、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径(Aspartate and glutamate metabolism)(P<0.05)。3.铜缺乏对獭兔真皮乳头细胞代谢的影响将獭兔真皮乳头细胞分为对照组和TM(铜螯合剂)处理组。对照组:基础培养基;TM处理组:基础培养基中分别加入0、0.1、1、2、5、10和20μM TM。处理真皮乳头细胞72 h后,观察铜缺乏对细胞活力和细胞内铜含量的影响。试验结果显示:TM(5μM)能显著降低细胞内铜含量(P<0.05),同时对细胞活力无显著影响(P>0.05)。蛋白质组学结果表明,与对照组相比,TM介导的selleckchem NN2211铜缺乏组256个蛋白表达水平显著下调,145个蛋白表达水平显著上调。GO功能注释和富集分析发现下调的差异蛋白主要涉及氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)、抗氧化活性(Antioxidant activity)、细胞色素c氧化酶活性(Cytochrome-c oxidase activity)和电子传递链(Electron transport chain)(P<0.05)。铜缺乏显著下调线粒体细胞色素c氧化酶亚基蛋白表达水平,包括线粒体细胞色素c核心亚基II(MTCO2)、NDUFA4线粒体复合物相关(NDUFA4)和细胞色素c氧化酶VIIA亚基2(COX7A2)(P<0.05)。Western blot结果表明,铜缺乏显著下调MTCO1和NDUFA4蛋白表达水平(P<0.05)。KEGG富集分析结果表明,下调差异蛋白显著富集到谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、中心碳代谢(Carbon metabolism)和丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)通路(P<0.05)。TM介导的铜缺乏显著下调糖酵解和TCA循环中多种代谢酶的蛋白表达包括,苹果酸脱氢酶1(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶NADP(+)1(IDH1)、乌头酸酶1(ACO1)、醛缩酶,果糖-二磷酸A(ALDOA)、烯醇化酶(ENO1)、磷酸葡萄糖变位酶2(PGM2)、磷酸葡萄糖酶1(PGM1)和葡萄糖磷酸异构酶(GPI)(P<0.05)。营养成分分析表明,铜消耗显著增加丙酮酸的消耗(P<0.05),导致真皮乳头细胞内柠檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸积累(P<0.05),但对葡萄糖消耗无显著影响(P>0.05)。此外,铜的损耗显著增加了调节碳输入TCA循环的丙酮酸羧化酶(PC)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、柠檬酸合酶(CS)和α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)(P<0.05)。Western blot分析证实,铜缺乏显著增加了二氢硫辛酸转乙酰基酶(DLAT)、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)和脂基化的蛋白水平(P<0.05)。通过使用2脱氧葡萄糖和寡霉素,发现铜缺乏显著抑制线粒体而不是糖酵解ATP的产生(P<0.05)。此外,去除TM或向含TM的培养基中加入铜能提高ATP产生和线粒体膜电位(MMP),并降低细胞总活性氧(ROS)水平。4.铜缺乏对獭兔真皮乳头细胞ALP活性的影响将獭兔真皮乳头细胞分为对照组和TM处理组。对照组:基础培养基;TM处理组:基础培养基中分别加入Antiobesity medications0、0.1、1、2和5μM TM。处理真皮乳头细胞72 h后,观察TM介导的铜缺乏对真皮乳头碱性磷酸酶(ALP)活性和ALPL表达的影响。试验结果显示,TM(5μM)和BCS(铜螯合剂)(1,000μM)介导的铜缺乏显著抑制了真皮乳头细胞ALP活性和ALPL表达(P<0.05)。为了进一步探究铜缺乏损伤真皮乳头细胞的ALP活性的机制,使用糖酵解抑制剂(2-DG)、腺苷酸转运体抑制剂(bongkrekic acid和ibipinabant)、几种已知的线粒体抑制剂(FCCP、鱼藤酮和寡霉素)处理真皮乳头细胞24 h后,观察对细胞增殖和ALP活性的影响。试验结果表明,寡霉素显著抑制了ALP活性(P<0.05);而2-DG对ALP活性无显著影响(P>0.05);两种ANT抑制剂对真皮乳头细胞的ALP活性无显著影响(P>0.05)。与寡霉素类似,鱼藤酮和FCCP都显著抑制了ALP活性(P<0.05),尽管两者对线粒体MMP有完全相反的影响(P<0.05)。此外,ROS诱导剂(Rosup)显著抑制了ALP活性(P<0.05),两种细胞间ROS清除试剂抗坏血酸和N-乙酰半胱氨酸显著抑制了铜缺乏和Rosup诱导的ROS生成(P<0.05)和ALP失活(P<0.05)。5.铜缺乏对獭兔真皮乳CHIR-99021头细胞铁死亡的影响将獭兔真皮乳头细胞分为对照组和BCS处理组。对照组:基础培养基;BCS处理组:基础培养基中分别加入0、100、200、500、1,000和2,000μM的BCS。处理真皮乳头细胞72h后,观察铜缺乏对真皮乳头细胞增殖和氧化应激的影响。试验结果显示,BCS(1,000μM)介导的铜缺乏显著降低MTCO1和NDUFA4蛋白表达水平(P<0.05)。在不影响细胞色素c的蛋白水平的前提下(P>0.05),BCS(1,000μM)介导的铜缺乏显著抑制了细胞色素c氧化酶活性(P<0.05)。BCS介导的铜缺乏显著诱导线粒体膜电位去极化(P<0.05),显著提高细胞总ROS水平(P<0.05)。BCS介导的铜缺乏显著提高了蛋白质羰基化(PCO)、脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)含量,显著抑制SOD1和GSH-Px活性,显著下调谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSH/GSSH)比率,显著下调GPX4蛋白表达水平(P<0.05)。透射电镜结果表明经BCS处理的DPCs线粒体萎缩,嵴形态减少。代谢组学结果表明,BCS介导的铜缺乏显著下调构成生物膜成分的甘油磷脂类化合物含量(P<0.05),显著增加了花生四烯酸、肾上腺酸、谷氨酸和谷氨酰胺的含量(P<0.05)。此外,BCS和Erastin联合使用显著增强了Erastin诱导的细胞死亡和铁死亡事件,包括显著增加MDA和细胞总ROS水平,显著增加GSH和半胱氨酸消耗,显著增加GSSG累积(P<0.05)。铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)部分阻止BCS介导的细胞死亡(P<0.05),并抑制细胞总ROS和LPO的生成(P<0.05)。总之,铜消耗通过线粒体扰动和抗氧化机制的降低增强了铁下垂。综上所述,本研究旨在阐明铜调节獭兔毛囊发育的分子和代谢机制。结果表明:(1)日粮中添加铜能提高獭兔毛囊密度。(2)培养基中添加铜能促进真皮乳头细胞增殖,提高ALP活性。(3)铜缺乏介导的细胞色素c氧化酶失活是真皮乳头细胞最主要的代谢缺陷,线粒体ROS产生是导致真皮乳头细胞特征性标志碱性磷酸酶活性降低。(4)铜缺乏通过扰动线粒体和降低抗氧化机制增强铁死亡。