背景慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一个重要的公共卫生问题,随着肾功能的进展,可进展至终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)即尿毒症阶段。血液透析(hemodialysis,HD)是常用的肾脏替代治疗方式之一,自体动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)是HD患者优选的透析通路。但AVF较高的早期成熟障碍及失功率限制了其临床应用。静脉流出道狭窄是AVF失功的常见原因,其病理基础是静脉内膜增生(neointimal hyperplasia,NIH)。NIH的发生发展与血管内病理机制有关,包括炎症、氧化应激等一系列级联反应和血管重塑,致血管狭窄、血栓形成,最终导致AVF的失功。C-kit是一种酪氨酸激酶受体,与配体干细胞生长因子(stem cell growth factor,SCF)结合后,可通过一系列信号通路参与细胞增殖分化的调控。C-kit已被证明在动脉损伤后再狭窄、动脉粥样硬化等方面发挥重要作用,但在AVF失功的关键机制NIH中的作用,尚未完全阐明。目的通过回顾性队列研究,探讨ESRD患者AVF建立后的通畅率及AVF失功的临床预测指标和相关生物学标志物;建立患者生物样本库,研究NIH导致AVF失功患者与首次行AVF患者,血管内膜中c-kit表达与血管形态学指标的变化及相关性,探讨下游磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路的表达变化;建立肾衰竭大鼠腹主动脉-下腔静脉内瘘(aortocaval fistulas,ACF)的双损伤模型,观察应用c-kit特异性抑制剂(伊马替尼)干预治疗后的不同时间点,ACF内膜中c-kit表达与血管形态学指标的变化及相关性,探讨抑制c-kit对ACF建立后NIH的影响。方法探讨290名ESRD患者初次行AVF手术后在12、24、36、48和60个月时AVF的通畅率;应用Cox比例风险回归分析,探讨AVF失功的独立危险因素;利用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked-immune-sorbent-assay,ELISA)测定血清 SCF 与内皮细胞激活指标E-选择素(E-selectin,ES)、磷脂酰基醇蛋白聚糖1(Glypican-1,GPC1)水平,并研究SCF与ES、GPC1之间的相关性。纳入首次行AVF和AVF因NIH而失功的ESRD患者进行研究(术前组,n=14;失功组,n=1 6)。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和弹力纤维(Verhoeff-Van Gieson,EVG)染色用于组织形态计量学分析;免疫组织化学方法检测c-kit在血管内膜中的表达,并与血管内膜面积及面积狭窄率进行相关分析;免疫荧光双标记法检测c-kit与α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)和CD31的共定位情况;蛋白免疫印迹法检测 c-kit 及相关的 PI3K/Akt 信号轴上 PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt473、P-Akt308和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达。先通过喂食含0.75%腺嘌呤饮食建立大鼠肾衰竭模型(肾衰竭组),对照组为正常饮食大鼠;再于肾衰竭大鼠基础上构建ACF模型,术后分别给予生理盐水灌胃(双损伤模型组)、伊马替尼灌胃(伊马替尼组)1周,ACF术后4周、6周和8周时取材;免疫组织化学方法检测血管内膜中c-kit的表达变化,EVG染色观察形态学指标变化;将c-kit在血管内膜中的表达量与血管内膜厚度及管腔面积进行相关性分析。结果Kaplan-Meier生存分析显示,ESRD患者前臂AVF的通畅率在12、24、36、48、60个月时分别为89.0%,84.1%,79.3%,77.6%和77.6%;在Cox比例风险回归粗分析中心血管疾病(cardiovascular disease,CVD),抗血小板药物,他汀类药物,D-二聚体(每增加1mg/L),血清白蛋白(每1g/L增加),和钙(每增加1g/L)与AVF失功独立相关,Laboratory biomarkersHR分别为 1.63(95%CI,1.00-2.65),1.92(95%CI,1.08-3.41),1.97(95%CI,1.05-3.69),1.08(95%CI,1.02-1.15),0.96(95%CI,0.92-0.99)和 0.37(95%CI,0.16-0.89)。Cox分析校正了混杂因素后,只有高血压与AVF失功相关(HR=8.47,95%CI=1.12-63.84);患者血清 SCF 与 ES、GPC1 均呈正相关(ES:R=0.42,P<0.001;GPC1:R=0.44,P<0.001)。ESRD患者AVF失功组的内弹力板面积、内膜面积、狭窄程度百分比和内膜中c-kit平均光密度值(average optical density,AOD)均显著高于术前组(P≤0.001);C-kit在血管内膜中的表达与内膜面积和管腔狭窄程度均呈正相关(内膜面积R=selleck合成0.744,P<0.001;狭窄程度R=0.923,P<0.001);免疫荧光染色提示,c-kit与α-SMA共定位,但未观察到与CD31共定位;蛋白免疫印迹法研究显示,失功组PI3K/Akt轴上c-kit、P-PI3K、P-Akt473和mTOR蛋白表达水平均显著高于术前组(P<0.05)。生化、病理染色及超声证实,可成功建立大鼠肾衰竭+ACF双损伤模型;肾衰竭组大鼠下腔静脉(infPidnarulex体外erior vena cava,IVC)内膜上有c-kit阳性表达,而对照组IVC内膜没有c-kit阳性表达,两组间静脉内膜厚度无统计学差异(P=0.06);伊马替尼组术后8周时可抑制ACF内膜中c-kit表达(P=0.04)。与双损伤模型组相比,伊马替尼组在术后6周、8周内膜厚度降低(术后6周P=0.03;术后8周P=0.001)、术后8周管腔面积显著增加(P=0.01);C-kit在ACF内膜中的表达量与内膜厚度呈正相关(R=0.664,P=0.003)与管腔面积呈负相关(R=-0.563,P=0.015)。结论1.本回顾性队列研究显示,ESRD患者前臂AVF建立后初级通畅率逐年降低,在60个月时初级通畅率降至77.6%。基线血浆D-二聚体水平未能预测AVF的失功。血清SCF与内皮细胞的激活有关,提示SCF及其特异性受体c-kit可能在AVF失功过程中发挥作用。2.在患者的血管组织中,c-kit的表达升高与NIH狭窄程度显著相关,且PI3K/Akt通路相关蛋白表达升高,提示c-kit及下游PI3K/Akt通路可能参与了 AVF中NIH的发生发展。3.腺嘌呤诱导的肾衰竭大鼠ACF双损伤模型成功建立后,应用c-kit特异性抑制剂伊马替尼进行干预治疗,可抑制ACF内膜中c-kit表达、减少内膜厚度、增加管腔面积,提示伊马替尼干预治疗具有延缓NIH的作用。