硒(Selenium,Se)是机体中必需的一种营养微量元素,对机体的健康至关重要。硒缺乏会引起鸡腹泻,甚至死亡,从而影响家禽养殖业的经济发展。腹泻与肠道健康相关,小肠是机体消化吸收的重要场所,也是吸收硒的重要部位,缺硒导致的肠道损伤会严重危害动物的健康和生产性能。研究发现缺硒会引发肠黏膜出血、肠道完整性破坏、氧化应激、炎性细胞浸润、上皮细胞坏死等。在机体内,硒以硒代半胱氨酸的形式发挥抗氧化功能,硒缺乏引起的氧化应激损伤与硒蛋白的失活有关,谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs)家族中的GPX3是具有抗氧化作用的硒蛋白之一,在肠道中起到减少氧化应激和炎症的关键作用。竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)是近年来发现的一种新型调控网络,涉及到一种新的转录后分子调控方式,长链非编码RNA(long non coding RNA,Lnc RNA)能够作为ce RNA竞争性地与micro RNA(miRNA)结合,调控细胞程序性坏死。越来越多的研究发现,硒蛋白与ce RNA调控网络存在互作关系,但缺硒引起的GPX3表达变化与ce RNA调控网络的相关性以及非编码RNA/GPX3轴在肉鸡缺硒性肠炎中的作用机制尚不明确。课题组前期研究发Staurosporine现,Lnc RNAWSF27、miR1696和GPX3存在ce RNA调控关系,为进一步确定Lnc RNAWSF27/miR-1696/GPX3轴在鸡缺硒性肠炎发生中的作用及调控机制,本试验复制了鸡缺硒肠炎模型,应用透射电镜和H&E染色观察十二指肠和空肠组织形态学变化,采用免疫组化、免疫印迹(western blot)、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等技术,检测25种硒蛋白、氧化应激、细胞程序性坏死、炎症因子和紧密连接相关基因及蛋白的表达。通过体外培养缺硒鸡小肠上皮细胞,建立鸡小肠上皮细胞Lnc RNAWSF27敲低模型、miR-1696敲低/过表达模型以及GPX3敲低/过表达模型,应用WB、q RT-PCR、AO/EB染色、ROS染色、荧光葡聚糖标记法、HRP示踪剂标记法等技术,检测肠氧化应激水平、细胞程序性坏死的激活情况、炎症程度和紧密连接相关因子的表达及细胞旁路通透性情况,旨在确定缺硒引起的肠GPX3表达变化与Lnc RNANN2211作用WSF27和miR1696的调节关系以及揭示Lnc RNAWSF27/miR-1696/GPX3轴调控鸡缺硒性肠炎发生的作用机制。试验结果如下:(1)采用低硒日粮饲喂肉鸡后,成功复制了硒缺乏肉鸡小肠损伤模型。H&E染色观察结果显示,硒缺乏肉鸡十二指肠和空肠的肌层断裂,肠腺、绒毛发生严重变形,肌层和黏膜固有层出现炎性细胞浸润,黏膜固有层细胞出现核固缩。透射电镜观察结果显示,缺硒肉鸡十二指肠、空肠肠绒毛断裂、溶解,细胞结构变形,细胞膜发生断裂,核溶解、消失,内质网肿胀断裂,线粒体肿大和嵴消失,细胞间紧密连接结构破坏,呈现出明显的坏死特征,表明缺硒引起鸡小肠组织坏死病变。(2)缺硒会影响鸡小肠硒蛋白表达,25种硒蛋白的m RNA水平检测结果显示,在空肠中GPX1、GPX3、Dio1、Dio3的表达降低较为显著,十二指肠中GPX3、Dio1、Dio2、Sel I、Sel K、Sel M、Sel W的表达降低较为显著,其中GPX3降低的最显著。根据之前的研究,为进一步验证肠GPX3与Lnc RNAWSF27和miR-1696的调节关系,在缺硒鸡小肠中检测到Lnc RNAWSF27表达显著降低,miR-1696的表达显著升高。同时,缺硒会导致鸡小肠上皮细胞中Lnc RNAWSF27、GPX3表达降低,miR-1696的表达升高。在鸡小肠上皮细胞中,敲低Lnc RNAWSF27会升高miR-1696的表达,从而降低GPX3的m RNA和蛋白水平。过表达或敲低miR-1696会降低或升高Lnc RNAWSF27、GPX3的表达。这表明在鸡小肠中Lnc RNAWSF27能够作为miR-1696的分子海绵,竞争性地结合miR-1696,调节miR-1696以及GPX3的表达。(3)对于缺硒造成鸡小肠氧化损伤的进一步研究结果显示空肠、十二指肠中CAT活性显著降低,GSH-px、GSH、SOD含量显著降低,MDA含量显著升高。此外,CAT、GST、HO-1、SOD1、SOD2的m RNA水平均显著降低。在缺硒鸡小肠上皮细胞中60%的硒蛋白m RNA表达水平降低,其中GPX3降低最为显著。氧化应激相关指标表达水平的检测结果显示CAT、GST、HO-1、SOD1、SOD2的表达均显著下调,ROS水平显著升高,NAC的处理会减少ROS水平以及细胞死亡,表明缺硒导致了鸡小肠氧化应激的激活。在鸡小肠上皮细胞中,分别敲低Lnc RNAWSF27、敲低GPX3、过表达miR-1696后,ROS水平增加,氧化应激相关指标的表达水平显著下调,伴随着程序性坏死的加剧,最终导致炎症反应,表明Lnc RNAWSF27低表达、miR-1696过表达、GPX3低表达会激活鸡小肠上皮细胞氧化应激。同时敲低Lnc RNAWSF27和miR-1696后,低表达的miR-1696能够缓解敲低Lnc RNAWSF27造成的鸡小肠上皮细胞氧化应激的发生,抑制细胞程序性坏死通路,阻止炎症反应,表明在鸡小肠上皮细胞中Lnc RNAWSF27/miR-1696能减少GPX3的表达引起氧化应激反应,加剧细胞程序性坏死,最终导致细胞炎症反应。(4)根据形态学呈现出的坏死特征,空肠、十二指肠免疫组化结果显示缺硒导Immunochromatographic tests致组织中RIPK1含量升高。对空肠、十二指肠组织内程序性坏死相关基因进行检测,结果显示缺硒增加鸡肠组织和鸡小肠上皮细胞中TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL表达水平,降低Caspase-8和FADD表达水平,表明缺硒导致鸡小肠发生程序性坏死。在鸡小肠上皮细胞中,分别敲低Lnc RNAWSF27、敲低GPX3、过表达miR-1696后,细胞程序性坏死水平增加,经Nec-1处理后有所缓解,表明Lnc RNAWSF27低表达、miR-1696过表达、GPX3低表达会造成鸡小肠上皮细胞程序性坏死。同时敲低Lnc RNAWSF27和miR-1696,发现低表达的miR-1696能够缓解敲低Lnc RNAWSF27造成的鸡小肠上皮细胞程序性坏死,表明Lnc RNAWSF27能够竞争性地结合miR-1696并降低GPX3的表达,参与缺硒造成的鸡小肠细胞程序性坏死。(5)病理组织学观察到肠肌层、黏膜固有层出现炎性细胞浸润后,进一步对组织中炎症因子进行检测,结果显示IL-1β、IL-2、IL-6、NF-κB、i NOS、COX-2、PTGE表达量显著上调,IL-10表达量显著下调。同时,缺硒导致鸡小肠上皮细胞中炎症反应增加,以上结果表明缺硒诱发鸡小肠炎症反应。在鸡小肠上皮细胞中,分别敲低Lnc RNAWSF27、敲低GPX3、过表达miR-1696后,炎症水平增加,经Nec-1处理后,促炎因子表达显著降低,表明Lnc RNAWSF27低表达、miR-1696过表达、GPX3低表达会加剧鸡小肠上皮细胞炎症反应。同时敲低Lnc RNAWSF27和miR-1696,发现低表达的miR-1696能够缓解敲低Lnc RNAWSF27造成的鸡小肠上皮细胞程序性坏死以及炎症反应,表明Lnc RNAWSF27/miR-1696能降低GPX3表达,加剧鸡小肠上皮细胞炎症反应。(6)缺硒会导致会激活空肠、十二指肠中ERK、JNK、p38的表达显著升高,同时,ZO-1、Occludin-1、RAPGEF2、Rap2c、Claudin-1的表达显著降低,而Rho A、Rock的表达显著升高。缺硒鸡小肠上皮细胞中MAPK通路基因水平升高,维持紧密连接完整性的相关基因表达降低,细胞旁路通透性增加,表明缺硒会导致鸡小肠紧密连接损伤。在鸡小肠上皮细胞中,分别敲低Lnc RNAWSF27、敲低GPX3、过表达miR-1696后,MAPK通路激活并加剧紧密连接损伤,经Nec-1处理后有所缓解,表明Lnc RNAWSF27低表达、miR-1696过表达、GPX3低表达会导致鸡小肠上皮细胞紧密连接损伤,增加细胞旁路通透性。同时敲低Lnc RNAWSF27和miR-1696,发现低表达的miR-1696能够缓解敲低Lnc RNAWSF27造成的鸡小肠上皮细胞紧密连接损伤,恢复细胞旁路通透性,表明Lnc RNAWSF27/miR-1696能降低GPX3表达,破坏鸡小肠上皮细胞紧密连接。综上所述,缺硒会通过抑制Lnc RNAWSF27的表达,导致miR-1696表达升高,从而降低GPX3的表达,低表达的GPX3会激活鸡小肠氧化应激,导致程序性坏死进而引发肠炎。我们的结果表明Lnc RNAWSF27、miR-1696、GPX3均参与调节缺硒诱导的鸡肠程序性坏死和炎症损伤,Lnc RNAWSF27和miR-1696之间的相互作用能够调控GPX3参与程序性坏死介导的鸡缺硒性肠炎,同时氧化应激的发生还会激活MAPK通路,诱导肠道紧密连接损伤。该结论丰富了对硒缺乏引起肠道损伤机制的理解,进一步充实了硒生物学功能,为比较医学提供借鉴。同时,该研究将有助于缺硒性肠炎的诊断及药物开发。