研究背景和目的肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,因其高发病率和高死亡率以及症状隐匿和发展迅速,严重危害人类生命健康。在中国,肺癌的发病率为17.9%、死亡率达23.8%,是国内临床上发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤且发病人数和死亡人数均位居全球首位。肺癌是环境致病因素与自身遗传等多因素共同作用诱发的一种多基因、多因素的复杂疾病。近年,肺癌的发病诱因呈现多元化的趋势。肺癌诱发的因素包括吸烟、空气污染、职业暴露、遗传因素等。肺癌的治疗预后与临床分期密切相关,BMS-354825抑制剂早诊断早治疗仍是最佳的治疗选择。然而,目前肺癌的诊断与治疗的手段尚未达到理想效果。因此,深入研究肺癌发病的相关异常基因和致癌信号通路,有助于我们更好的预防和治疗该疾病。纤维蛋白-2(Fibrillin-2,FBN2)是微纤维的重要组成部分,参与了人体结缔组织中弹性纤维的形成。FBN2基因表达异常与多种遗传性结缔组织疾病相关,包括先天性挛缩性蛛网膜下腔积液(CCA)、黄斑变性(MD)和肌病等。随着生物信息学研究技术的发展,FBN2被认为与癌症的发生发展有密切关系,在食道癌、结肠癌、卵巢癌等多种癌症组织中表达异常,并与其生存预后密切相关。在此基础上,我们推测FBN2基因可能在肺癌的发生与发展过程中发挥广泛的促癌作用。本课题在前期通过基因测序结合生物信息数据库分析肺癌与FBN2表达及其与预后的关系,明确FBN2作为肺癌诊断标志物及治疗靶点的潜能,并进一步分析FBN2在肺癌发生和发展的作用机制。第一部分FBN2基因与肺癌患者中表达异常研究目的探索肺癌临床样本的基因表达差异,寻找和研究与肺癌发病及恶性发展相关的异常基因,为肺癌的诊断与治疗提供诊断标志物及治疗靶点。研究方法本研究通过全外显子测序对5例临床收集的肺肿瘤样本及对应瘤旁组织进行多基因突变谱分析,探讨其与临床病理特征的关系,并寻找可以作为肺癌诊断和治疗靶点的突变基因;通过荧光定量PCR检测97例肺癌组织和对应的癌旁组织中FBN2基因的m RNA转录水平;通过石蜡包埋的肺癌组织切片并进行免疫组织化学实验分析FBN2蛋白在97例临床肿瘤样品中表达水平,并结合病理学分数分析FBN2蛋白表达水平与患者临床病理特征(年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、组织学类型、分化程度及吸烟史等)的相关性;通过TCGA数据库和GTEx数据库对比分析肺腺癌和肺鳞癌肿瘤组织及正常组织的FBN2基因表达差异及预后生存期的关联性,同时通过随访记录97例肺癌患者的实际生存情况并采用Kaplan-Meier法进行分析,采用COX法筛选影响肺癌进展的独立危险因素。绘制FBN2与常见肺癌血清标志物(NSE、SCC、CA50、CEA、VEGF)诊断肺癌的ROC曲线。结果全外显子测序分析结果显示,在肺癌早期基因突变以C-T置换的错义突变为主,其中突变频率最高的基因分别为TTN、OBSCN、SRPX、PIEZO1、PCNXL2、NEB、MDN1、MACF1、FBN2和BRCA2;基于分析结果和文献调研,本研究认为FBN2与肿瘤发生和发展有密切相关性。荧光定量PCR实验结果显示,FBN2基因的m RNA水平在肺肿瘤组织的显著升高(P<0.05);免疫组织化学分析结果显示,FBN2在肺肿瘤组织中高表达,主要分布于癌细胞边缘,且与患者的TNM分期、淋巴结转移及组织学类型、SCC和VEGF表达水平具有显著相关性,提示该基因的表达高低可能与肿瘤细胞的生长增殖具有相关性(P<0.05)。TCGA数据库和GTEx数据库分析结果显示,在肺鳞癌组织中,FBN2的表达显著升高,而肺腺癌组织则无明显差异,此外FBN2基因的表达高低与肺癌患者预后生存期具有相关性。分析97例患者的实际生存情况,结果显示不同TNM分期、VEGF表达水平、FBN2表达水平、远处转移情况与无进展生存期(Progression-free survival,PFS)显著相关,其中FBN2(-)患者的PFS显著长于FBN2(+)患者[(34.57±0.65)月vs(24.71±0.97)月,P<0.05]。COX分析结果也显示FBN2为影响肺癌预后的独立危险因素(P<0.05)。绘制FBN2与常见肺癌血清标志物(NSE、SCC、CA50、CEA、VEGF)诊断肺癌的ROC曲线,结果显示NSE、SCC的诊断价值较高(AUC均=0.81,P<0.01),CA50、FBN2诊断价值次之(AUC均=0.80,P<0.01)。结论FBN2在肺肿瘤CB-839临床试验组织中高表达,且与患者的TNM分期、淋巴结转移及组织学类型具有显著相关性;FBN2的高表达不利于肺癌患者预后。第二部分FBN2基因对肺癌细胞的恶性生物学功能影响及机制研究研究目的本研究前期发现FBN2的表达与肺癌预后存在显著关联性,为进一步探讨FBN2在肺癌中的作用机制,以及明确FBN2作为肿瘤标志物的潜能,本研究开展以下实验。研究方法通过PCR实验和Western blot实验检测肺癌细胞系(PC-9、H1975、H1640、H441、A549)和人正常肺上皮细胞BEAS-2B的FBN2基因的m RNA和蛋白质表达水平;构建FBN2基因敲低的PC-9细胞系和H1640细胞系并通过实时荧光定量PCR和Western blot实验验证敲低结果;CRISPR-cas9系统在肺癌细胞中构建FBN2点突变的细胞系。通过台盼蓝染色实验、克隆形成实验和Transwell实验确定FBN2基因对肺癌细胞生长能力、细胞增殖能力和细胞转移与侵袭能力的影响;通过实时荧光定量PCR和Western blot实验研究FBN2基因敲低的PC-9细胞系EMT相关分子的影响(E-钙黏蛋白,N-钙黏蛋白,波形蛋白,Snail锌指转录因子超家族成员:Slug,Snail及Twist);通过Western blot实验研究敲低FBN2基因后对PC-9细胞FAK/ERK信号通路活性的影响;通过裸鼠皮下移植瘤实验human medicine研究FBN2敲低对PC-9细胞的体内增殖能力。结果实时荧光定量PCR和Western blot实验的结果显示,FBN2基因在肺癌细胞系中的表达水平均显著高于人正常肺上皮BEAS-2B,其中H160和PC-9细胞表达最高。台盼蓝染色实验、克隆形成实验和Transwell实验结果显示,敲低FBN2基因抑制肺癌细胞的生长、增殖、转移与侵袭,且具体的机制可能是通过抑制癌细胞EMT相关分子表达和抑制FAK/ERK信号通路活性。此外,裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,敲低FBN2基因抑制肺癌细胞的体内增殖。研究结论FBN2通过FAK/ERK信号通路调控肺癌细胞的EMT进而参与其增殖与转移。全文总结本研究探索FBN2在肺癌发展中的临床意义及相关分子机制,得到如下结论:FBN2基因在肺癌组织中发生高频突变且与患者的TNM分期、淋巴结转移及组织学类型具有显著相关性,FBN2高表达不利于患者的预后;体外实验显示,FBN2参与肺癌细胞PC-9和H1640的增殖、侵袭和转移,其机制可能是通过FAK/ERK信号通路调控癌细胞的EMT相关分子表达。因此,FBN2可以作为肺癌诊断、治疗及预后判断的一个分子指标。