目的:本研究以高脂饮食饲养小鼠为研究对象,通过腹腔注射20%L-精氨酸制备重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型,以16s r DNA高通量测序和GC-MS代谢组学为技术手段,探讨高脂饮食、肠道菌群、代谢产物和SAP四者之间关系。在此基础上,以中药大黄附子汤作为干预措施,从肠道菌群和代谢产物的角度探讨大黄附子汤治疗高脂血症性重症急性胰腺炎(hyperlipidaemic severe acute pancreatitis,HLSAP)的作用机制,寻找大黄附子汤作用的关键靶点。材料与方法:1.1动物分组96只C57BL/6小鼠随机分为2大组,高脂饮食组(HFD组)和正常组饮食组(ND组),每组各48只小鼠。高脂饮食组又分为对照组(HFD)、大黄附子汤对照组(HFDD)、模型组(HFD-M)和治疗组(HFD-M-D)四组。正常饮食组又分为对照组(ND)、大黄附子汤对照组(ND-D)、模型组(ND-M)和治疗组(ND-M-D)四组。分别给予高脂饮食或正常饮食饲养8周,并观察小鼠饮食饮水及活动状态、毛发,大小便情况。1.2动物模型的制备与取材模型组和治疗组给予腹腔注射20%L-精氨酸以制备SAP模型;大黄附子汤对照组和治疗组在SAP制备成功后每隔12h给予大黄附子汤灌胃。实验持续48h,实验结束后,取血标本进行ELISA测定血清淀粉酶(AMS)、内毒素(LPS)、血脂(TG,TC,LDL,HDL),炎症因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)水平。取胰腺、肺、回肠和结肠行常规病理切片。用棉签拭子蘸取回肠和结肠内容物,进行GC-MS代谢组学分析;用棉签拭子刮取肠黏膜表层,进行l6s r DNA高通量测序,测定小鼠回肠和结肠黏膜相关肠道菌群变化。结果:论文一C57BL/6小鼠HLSAP模型的建立及大黄附子汤的干预作用实验周期为8周,ND组小鼠各方面均正常。HFD组小鼠前期正常,后期逐渐出现精神困倦,懒散少动,毛发油量,摄水量时有增加,小便正常,大便偶有便溏。HFD组在4,6,8周体重明显超过正常饮食喂养ND组(P<0.001)。HFD组小鼠的血清总胆固醇(TC),甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(L更多DL)均显著高于ND组(P<0.01)。高密度脂蛋白(HDL)低于正常饮食组(P<0.05)。ND-M组血清AMS,胰腺、肺、回肠和结肠病理评分,LPS,TNF-α,IL-1β和IL-6显著高于ND组和ND-D组(P<0.01)。HFD-M组各项指标也同样高于HFD组与HFD-D组(P<0.01)。经过大黄附子汤治疗后,ND-M-D组和HFD-M-D组各项指标均显著降低(P<0.001)。此外,HFDM组血清LPS、TNF-α,IL-1β和IL-6均显著高于ND-M组(P<0.05)。论文二HLSAP小鼠回肠和结肠黏膜相关菌群的变化及大黄附子汤的干预作用经过16s高通量测序数据优化处理,96个样本共获得5717346条优化有效序列。稀释性曲线显示此次测序深度足够,覆盖度良好。首先,高脂饮食造成了菌群的Renewable lignin bio-oil显著变化。在门水平上,与ND组比较,HFD组回肠段和结肠段均存在Bacteroidetes的降低,Firmicutes的升高,以及Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)比值比的显著升高。在属水平上,回肠段Faecalibaculum显著升高,selleck HPLC结肠段norank_f_Bacteroidales_S24-7_group显著降低。HLSAP组小鼠回肠和结肠均发生明显的菌群失调。回肠段主要变现为Bacteroidetes的显著降低及F/B比值比的增加,以及Escherichia-Shigella的显著增加。结肠段主要表现为Proteobacteria的显著升高。大黄附子汤的治疗后,回肠Proteobacteria的EscherichiaShigella显著降低,unclassified_f_Lachnospiraceae和Akkermansia显著升高。结肠段Proteobacteria显著降低,同时增加了Blautia的丰度。正常饮食干预下SAP菌群在门和属水平的变化基本与HLSAP一致。HLSAP与SAP比较,HLSAP回肠和结肠段Proteobacteria以及Escherichia-Shigella显著高于SAP,同时HLSAP还具有更高丰度的粪杆菌属(回肠)和脱硫弧菌属(结肠)。Spearman相关性分析显示,在门水平,Bacteroidetes与LPS成负相关,Proteobacteria与LPS成正相关。在属水平上,norank_f_Bacteroidales_S24-7_group,unclassified_f_Lachnospiraceae与LPS成负相关,Escherichia-Shigella,Enterococcus,Faecalibaculum与LPS成正相关关系。论文三HLSAP小鼠回肠和结肠段代谢产物的变化及大黄附子汤的干预作用GC-MS代谢组学测定,最终得到224种代谢物,经KEGG化合物分类共注释到91个化合物,共涉及39条代谢通路。经样本比较分析,KEGG化合物和功能通路分析,差异代谢物筛选,KEGG富集通路分析,高脂饮食干预下,回肠段,IHFD-M组与IHFD组比较,富集通路一共涉及到3种差异代谢物,分别是硬脂酸,亚油酸,甘油。其中模型组上调了硬脂酸,亚油酸,下调了甘油。IHFD-M-D与IHFD-M组比较,涉及的差异代谢物为肉豆蔻酸。治疗组下调了肉豆蔻酸。结肠段,CHFD-M组与CHFD组比较,富集通路一共涉及到6种差异代谢物,其中尿嘧啶,胆固醇,6-phosphogluconic acid表达上调,硬脂酸,麦芽糖,亚油酸表达下调。CHFD-M-D组与CHFD-M组比较,富集通路一共涉及到2种差异代谢物,分别是富马酸和6-phosphogluconic acid。正常饮食干预下,回肠段,IND-M组与IND组比较,富集代谢通路匹配到8种差异代谢物,其中甘油,半乳醇,果糖上调,黄嘌呤,Myo-inositol,L-Malic acid,L-谷氨酸,花生四烯酸表达下调。IND-M-D组与IND-M组比较,匹配到8种差异代谢物,分别是棕榈酸,尿嘧啶,硬脂酸,亚油酸,L-谷氨酸,乙醇胺,肌酸,花生四烯酸,其中棕榈酸,其余均为下调。结肠段,CND-M组与CND组比较,匹配到13种差异代谢物。其中蔗糖,琥珀酸,Myo-inositol,L-Malic acid,半乳醇上调,硬脂酸,角鲨烯,棕榈酸,肉豆蔻酸,亚油酸,氢化肉桂酸,甘油,乙醇胺下调。CND-M-D组与CND-M组比较,匹配到5种差异代谢物,其中棕榈烯酸,肉豆蔻酸,乙醇胺,3-hydroxybutyric acid上调蔗糖下调。两种饮食比较,回肠段,高脂饮食上调了肉豆蔻酸,二十四烷酸,甘油,山核桃酸,花生酸,下调硬脂酸,L-Malic acid,亚油酸。结肠段,高脂饮食上调了棕榈烯酸,肉豆蔻酸,Myo-inositol,二十四烷酸,山核桃酸,花生酸。下调了牛磺酸,琥珀酸,草酸,α-生育酚。两种饮食干预下SAP模型比较,回肠段,IHFD-M组与IND-M组比较,最终匹配到4种差异代谢物,其中上调棕榈烯酸,棕榈酸,肉豆蔻酸,下调半乳醇。CHFD-M组与CND-M组比较,匹配到13种差异代谢物,其中上调6种,分别为角鲨烯,棕榈烯酸,肉豆蔻酸,二十四烷酸,山核桃酸,花生酸,下调7种,分别为蔗糖,琥珀酸,硬脂酸,L-Malic acid,亚油酸,半乳醇,24,25-dihydrolanosterol。结论:1大黄附子汤能够显著降低HLSAP小鼠的血清AMS,改善胰腺、肺、回肠和结肠病理组织评分,降低LPS和炎症标志物水平,降低死亡率,疗效显著。2高脂饮食在SAP发生前即对肠道菌群和肠道代谢产物形成影响,其变化在特定菌群和代谢产物上与SAP发生后菌群和代谢的变化具有共同趋势。其中菌群方面,HLSAP回肠和结肠段Proteobacteria以及Escherichia-Shigella显著高于SAP,同时HLSAP还具有更高丰度的粪杆菌属(回肠)和脱硫弧菌属(结肠)。在代谢产物方面,两者都存在肉豆蔻酸的显著增高。这可能是导致HLSAP较其他类型SAP严重的潜在标志物。3大黄附子汤可能通过改变菌群结构,降低有害兼性厌氧菌Proteobacteria及Escherichia-Shigella(属于Proteobacteria),Desulfovibrio(属于Proteobacteria)的丰度,提高回肠段益生菌norank_f_Bacteroidales_S24-7_group,unclassified_f_Lachnospiraceae,Akkermansia的丰度,结肠段Blautia丰度发挥治疗HLSAP的作用。4在代谢产物方面,大黄附子汤可能通过调节内源性大麻素信号,调节肉豆蔻酸和富马酸的而发挥治疗作用。