研究目的:非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liverCL13900配制 disease,NAFLD)是以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征,脂质代谢紊乱被认为是发病的主要因素之一。脂联素在运动改善肝脏代谢紊乱中发挥重要作用。但其作用机制尚未完全清楚。最新研究显示,miR-130b-5p在NAFLD小鼠肝脏中过表达,并可以促进肝脏脂质积累。生物信息学分析也显示,miR-130b-5p可以靶向脂联素的重要下游因子PPARα。但尚未发现脂联素与miR-130b-5p的关系研究,运动与miR-130b-5p的研究也未见报道。基于此,本研究目的:1.验证并探寻脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号通路在脂质代谢中的作用及可能机制。2.探索脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号途径在运动改善NAFLD中的作用和机制。研究方法:离体部分:用miR-363-3p的模拟物处理AML12肝实质细胞,并收集处理后的细胞;通过计算机生物信息学软件预测miR-130b-5p和PPARα的结合序列,构建野生型和突变型PPARα的重组质粒后,在293T细胞中进行双荧光素酶报告基因实验。在体部分:10只C57BL/6背景12周龄的雄性脂联素敲除(Adipoq-/-)小鼠及其同窝野生型(WT)小鼠分别随机分为:野生对照(WT+Vehicle,n=5)组、野生运动(WT+EXE,n=5)组、敲除对照(Adipoq-/-+Vehicle,n=5)组和敲除运动(Adipoq-/-+EXE,n=5)组。40只C57BL/6雄性小鼠在标准的实验动物房适应性饲养一周后,随机分为两组,分别接受标准饲料和高脂饲料(HFD)喂养。8只小鼠进食标准饲料(ND,NC组,n=8),32只小鼠进食高脂饲料(HFD,n=32)。经过10周喂养后再将HFD组小鼠再被随机分成4组:高脂对照(HFselleck NSC 119875D+Vehicle,n=8)组、高脂运动干预(HFD+EXE+Vehicle,n=8)组、高脂脂联素干预(HFD+Acrp30,n=8)组、高脂运动脂联素干预(HFD+EXE+Acrp30,n=8)组。Adipoq-/-、WT和HFD的运动组进行8周的跑台运动,并且HFD的4组在训练最后一周接受为期一周的腹腔注射重组脂联素(Acrp30,i.p.28g/kg-1day-1)或相应赋形剂(i.p.0.9%氯化钠[生理盐水]注射液,0.5ml/day)干预。跑台运动的具体方案为:2天的适应性训练后,小鼠以20m/min、60min/d的运动负荷,每周训练6天,休息1天,共训练8周。所有干预结束后,禁食12小时,使用血糖监测系统从尾静脉测量血糖。并在最后一次运动后36-48小时收集血浆和肝脏组织。之后通过HE染色观察小鼠肝脏形态学变化;用ELISA法测定肝功转氨酶、血脂指标、肝匀浆FFA、TG和血清脂联素的含量;制样后通过RT-PCR的方法检测小鼠肝组织中miR-130b-5p和脂质代谢相关指标的基因表达水平。研究结果:1.在AML12细胞中过表达miR-130b-5p后,PPARα的mRNA和蛋白表达均显著下降(P均<0.01)。荧光素酶报告基因结果分析表明,与突变型3'-UTR(MUT PPARα 3'-UTR)相比,miR-130b-5p模拟物可以抑制具有野生型PPARα3'-UTR(WT PPARα 3'-UTR)的荧光素酶活性(P<0.01)2.WT、Adipoq-/-小鼠分别进行8周跑台运动。结果显示,与WT组相比,Adipoq-/-组小鼠肝脏的miR-130b-5p的表达显著升高(P<0.01),PPARA、CPT1A、ACOX1和FABP1的mRNA表达明显下降(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01);与WT组相比,WT+EXE组小鼠肝脏的miR-130b-5p的表达显著降低(P<0.05),PPARA、CPT1A、ACOX1、FABP1和CD36的mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01),SREBP1和FASN的mRNA表达显著下降(P均<0.01);与Adipoq-/-相比,Adipoq-/-+EXE组小鼠肝脏的PPARA、CPT1A、ACOX1、FABP1和CD36的mRNA表达显著上升(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05),FASN的mRNA表达显著下降(P<0.01);与WT+EXE组相比,Adipoq-/-+EXE组小鼠肝脏的miR-130b-5p的表达显著升高(P<0.01),PPARA、CPT1A、ACOX1和CD36的mRNA表达显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。3.18周HFD喂养构建NAFLD小鼠模型,并同时进行脂联素、运动以及脂联素运动联合干预。结果显示:NC组小鼠的肝脏形态正常,表面abiotic stress呈光泽的红褐色,质地柔韧;HFD+Vehicle组小鼠的肝脏体积、重量明显增加,表面呈粗糙的红黄相间色,质地软脆,包膜紧张,切开后有油腻感。HE染色也显示,NC组肝脏正常,没有出现明显的脂肪肝变化;HFD+Vehicle组出现了明显的脂肪变性(细胞体积增大,出现大量脂滴,一些细胞核被挤偏移,出现肝细胞破裂融合的脂肪囊肿。);与NC组相比,HFD+Vehicle组小鼠体重、腹腔脂肪重量、体脂百分率、肝指数和血清ALT、AST(P均<0.01)。血清TG、TC、HDL-C、LDL-C及肝组织的TG、FFA含量均显著升高(P均<0.01)。提示NAFLD造模成功,并出现肝脏脂质代谢紊乱。形态学肝脏观察显示,HFD+Acrp30组肉眼观察体积近似正常组,表面光泽的奶黄色或淡黄色,质地较脆,但韧性好于HFD组;HFD+EXE+Vehicle组和HFD+EXE+Acrp30组小鼠的肝脏形态正常,与正常组几乎没有区别;HE染色显示三个干预组肝脏脂肪变性程度显著降低。与HFD+Vehicle相比,HFD+EXE组、HFD+Acrp30、HFD+EXE+Vehicle组体重、腹腔脂肪重量、体脂百分率、肝指数和血清ALT、AST、血清TG、TC、HDL-C、LDL-C及肝组织的TG、FFA均出现显著下降(P<0.01或P<0.05)。提示三种干预均能显著改善NAFLD和肝脏脂质代谢紊乱。4.基于3的模型下,脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号通路的表达情况:与NC组相比,HFD+Vehicle组小鼠血清脂联素含量显著降低(P<0.01)。肝脏miR-130b-5p水平显著升高(P<0.01),PPARA、CPT1A和ACOX1的mRNA表达显著降低(P均<0.01),FABP1、CD36、SREBP1和FASN的mRNA表达显著升高(P均<0.01)。与HFD+Vehicle组相比,HFD+EXE+Vehicle组小鼠血清脂联素含量显著升高(P<0.01),肝脏miR-130b-5p水平显著降低(P<0.01),PPARA和CPT1A的mRNA表达显著升高(P<0.01,P<0.05),FABP1、CD36、SREBP1和FASN的mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。与HFD+Vehicle组相比,HFD+Acrp30组小鼠血清脂联素含量显著升高(P<0.01),肝脏miR-130b-5p水平显著降低(P<0.01),PPARA A的mRNA表达显著升高(P<0.01),FABP1和CD36的mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。与HFD+Vehicle组相比,HFD+EXE+Acrp30组小鼠血清脂联素含量显著升高(P<0.01),肝脏miR-130b-5p水平显著降低(P<0.01),PPARACPT1A和ACOX1的mRNA表达显著升高(P均<0.01),FABP1、CD36、SREBP1和FASN的mRNA表达显著降低(P均<0.01)。与HFD+EXE+Acrp30组相比,HFD+EXE+Vehicle组小鼠肝脏miR-130b-5p显著升高(P<0.01),肝脏PPARA和ACOX1的mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.01);与HFD+EXE+Acrp30组相比,HFD+Acrp30组小鼠肝脏miR-130b-5p显著升高(P<0.01),肝脏CPT1和FABP1的mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05),CD36、SREBP1和FASN的mRNA表达显著升高(P均<0.05)。提示且联合干预对各个指标的改善效果都要优于单一干预效果。研究结论:1、脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号通路参与调控肝脏脂肪酸β-氧化、脂肪酸摄取和从头脂肪生成。2、运动通过脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号通路调控肝脏脂质代谢。3、长期高脂饮食引起肝脏脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号受损,肝脏脂质代谢异常,可能是诱发非酒精性脂肪肝病的原因之一。4、运动和脂联素干预可能通过改善肝脏脂联素/miR-130b-5p/PPARα信号通路,缓解脂质代谢异常,防治非酒精性脂肪肝病。