姜酚是姜(Zingiber officinale Rose.)中主要活性成分,课题组前期研究结果表明炮姜在炮制过程中姜酚类成分含量明显降低,其中,6-姜酚的含量降低在15%～42%之间,而姜烯酚类的含量则显著升高,且在炮制过程中会有新成分姜酮的产生,这表明,干姜炮制成炮姜后,姜酚类成分的“质”和“量”发生了转变。但是,炮制对炮姜姜酚类成分的转化规律及其活性影响等尚不完全明确,值得进一步研究。目的:明确炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律,为炮姜的炮制工艺和炮制机理提供参考;探讨转化产物6-姜烯酚、姜酮与原型成分6-姜酚对HUVEC的保护作用及机制,为转化后药效变化的内在机理提供依据。方法:1.炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律及抗氧化活性变化研究采用UPLC法测定干姜和不同砂烫工艺炮姜样品中的6-姜烯酚、姜酮和6-姜酚含量;采用油浴加热模拟炮制6-姜酚单体,考察不同时间、温度条件下6-姜酚及其转化产物的含量变化规律;测定不同砂烫工艺炮姜样品及6-姜酚模拟炮制产物的体外抗氧化活性,并采用SPSS 23.0进行6-姜酚含量与抗氧化活性之间的相关性分析Smoothened Agonist分子量。2.基于网络药理学探讨6-姜酚及其转化产物改善血管内皮损伤的作用机制通过Swiss Target Prediction数据库、Pharm Mapper数据库获取转化产物6-姜烯酚、姜酮和early response biomarkers原型成分6-姜酚的成分靶点,通过Gene Cards数据库获取血管内皮损伤靶点,采用Venn网站筛选三个成分靶点和血管内皮损伤靶点的交集靶点,通过STRING在线数据库对交集靶点构建PPI关系网络,通过DAVID数据对交集靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析,采用Cytoscape 3.8.0软件绘制“成分-靶点”相互作用网络图、PPI相互作用网络图及“成分-靶点-通路”网络互作图并进行拓扑分析。3.6-姜酚及其转化产物通过PI3K-AKT-NRF2通路调控铁死亡改善LPS诱导的HUVEC损伤实验分为正常组、LPS模型组、LPS+6-姜烯酚组、LPS+姜酮组、LPS+6-姜酚组。采用CCK8法检测各组细胞活力,采用Hoechst 33258染色观察各组细胞凋亡情况,采用ELISA及亚铁嗪微板法测定各组IL-1β、TNF-α、ROS、MDA、SOD、GSH和Iron表达水平,通过q RT-PCR对各组HUVEC相关基因表达水平进行检测,通过Western Blot检测HUVEC相关蛋白的表达。结果:1.炮姜炮制过程中6-姜酚的转化规律及抗氧化活性变化研究随着砂烫时间的延长和温度的升高,炮姜样品中6-姜烯酚和姜酮的含量逐渐升高,6-姜酚的含量逐渐下降;模拟炮制确认了6-姜酚经油浴加热后会部分转化为6-姜烯酚和姜酮;炮姜和6-姜酚模拟炮制样品中6-姜酚含量与抗氧化活性之间存在显著正相关。2.基于网络药理学探讨6-姜酚及其转化产物改善血管内皮损伤的作用机制通过相关数据库的筛选,得到3个成分靶点共255个,血管内皮损伤靶点986个,交集靶点172个,Cytoscape 3.8.0软件拓扑分析筛选出包括SRC、PIK3R1、PIK3CA、GRB2、HSP90AA1等10个关键靶点,GO富集分析和KEGG富集通路的结果发现转化产物6-姜烯酚、姜酮和原型成分6-姜酚的血管内皮保护作用主要涉及细胞迁移的正向调节、细胞凋亡过程的负向调节、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的正向调节、细胞增殖正向调节等,3者作用于PI3K-AKT信号通路,调控其下游的靶基因和靶蛋白,结合文献分析,推测6-姜烯酚、姜酮和6-姜酚对血管内皮的保护作用可能与通过PI3K-AKT信号通路及下游NRF2/HO-1途径调控铁死亡相关。3.6-姜酚及其转化产物通过PI3K-AKT-NRF2通路调控铁死亡改善LPS诱导的HUVEC损伤。结果表明,LPS造模后,与正常组相比,细胞活力会显著下降,细胞形态会发生改变,且细胞核出现破裂等现象,而LPS+6-姜烯酚、LPS+姜酮和LPS+6-姜酚给药组细胞活力会显著升高,细胞形态也有明显的改善。ELISA的结果显示LPS模型组能够增加IL-1β、TNF-α、ROS、MDA、Iron等指标水平的表达,降低SOD和GSH的表达水平,q RT-PCR结果表明LPS模型组能够上调PI3K、AKT、NRF2等通路基因的表达水平,上调促进细胞凋亡的Bax/Bcl-2基因表达量比值,下调铁死亡负调控基因GPX4、SLC7A11的表达量,Western Blot结果表明各组的PI3K、AKT表达量无明显差异,但LPS模型组能够显著降低p-PI3K、p-AKT,其余指标与q RT-PCR结果一致,而LPS+6-姜烯酚、LPNSC 127716 molecular weightS+姜酮和LPS+6-姜酚给药组能够逆转以上趋势。结论:1本课题通过模拟炮制结合体外抗氧化的方法明确了炮姜炮制过程中6-姜酚会转化为6-姜烯酚和姜酮,随着砂烫时间的延长和温度的升高,6-姜烯酚和姜酮的含量逐渐升高,6-姜酚的含量逐渐下降,且6-姜酚含量与抗氧化活性之间存在显著正相关。2在文献分析的基础上,通过网络药理学结合体外细胞验证,明确了转化产物6-姜烯酚、姜酮和原型成分6-姜酚通过激活PI3K-AKT-NRF2通路抑制铁死亡改善LPS所致的HUVEC氧化应激损伤。