目的胶质瘤(glioma)是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,5年生存率不足4%-5%。近些年来,胶质瘤微环境中胶质瘤来源外泌体的功能逐渐被重视,有研究报道,胶质瘤来源的外泌体可促进胶质瘤的生长,也可以抑制免疫系统功能的发挥,胶质瘤复杂的微环境使得胶质瘤的治疗难度增加。树突状细胞是一种重要的免疫细胞,参与初始T细胞的活化。然而在胶质瘤微环境中树突状细胞的功能被抑制,导致树突状细胞失能的其中一种原因是胶质瘤微环境中树突状细胞的脂质堆积。由于外泌体(exosomes)被发现具有脂质传递的作用,所以我们猜测胶质瘤微环境中树突状细胞脂质堆积与胶质瘤分泌的外泌体具有一定关系,并且脂肪酸的积累及氧化容易诱发铁死亡。因此,本研究主要采用大鼠胶质瘤模型以及体外原代培养的树突状细胞探讨胶质瘤来源的外泌体与树突状细胞脂质堆积的关系以及对树突状细胞铁死亡的影响。方法本研究选用雄性(180-220g)的Sprague-Dawley(SD)大鼠进行胶质瘤造模,分为两组:胶质瘤、假手术(sham)组,在种瘤14 d取材,提取脑和脾脏中的淋巴细胞,用脂质染料Bodipy493/503染色并通过流式细胞术观察树突状细胞脂质积累情况。采用二代慢病毒感染技术构建Rab27a敲低的C6胶质瘤细胞系,通过Western Blot筛选有效的干扰靶点以及检测外泌体标志蛋白TSG101、Alix的表达来评估外泌体分泌含量变化。Rab27a敲低的C6胶质瘤细胞构建成功后进行造模,将模型分为Ctrl组和sh-Rab27a组,通过流式细胞术观察树突状细胞脂质堆积累及脂质过氧化Liperfluo的水平。在体外实验中,我们采用超速离心法对胶质瘤细胞外泌体进行提取,采用骨髓诱导分化的方式获得树突状细胞,通过形态学观察以及流式细胞术对树突状细胞进行鉴定。用激光共聚焦显微镜观察树突状细胞对外泌体的摄取情况。通过CCK8、LDH、Elisa实验检测胶质瘤外泌体对树突状细胞活性和功能的影响。在铁死亡的检测中,分组如下:PBS、EXO、铁死亡诱导剂RSL3、EXO+铁死亡抑制剂Lip-1、EXO+铁死亡抑制剂Fer-1,分别检测铁离子、谷胱甘肽、脂质过氧化物、ROS的含量,通过透射电镜观察线粒体形态变化,通过Western Blot检测相关铁死亡蛋白。实验数据使用单因素方差分析(One way ANOVA)和卡方检验进行统计学处理,使用Graphpad prism 8、SPSS19.0进行统计分析,数据用均数±标准差(means±SD)表示,其中P<0.05视为具有统计学意义。结果1、抑制胶质瘤外泌体分泌能降低脑内浸润树突状细胞脂质含量在14 d进行胶质瘤模型取材,以假手术(sham)为对照,提取脑和脾脏中的单核细胞,CD45+CD103+标记树突状细胞,Bodipy 493/503染色流式观察脂质积累情况,发现胶质瘤模型组脑浸润的树突状细胞中脂质含量多于sham组,两组脾脏中树突状细胞脂质含量变化不明显。然而在敲低Rab27a减少胶质瘤外泌体分泌的胶质瘤模型中,通过Bodipy 493/503染色发现与Ctrl组相比sh-Rab27a组脑浸润CD4点击此处5~+CD103~+树突状细胞脂质积累减少。2、抑制胶质瘤细胞外泌体分泌能增加脑内CD8~+T、树突状细胞的数量,促进树突状细胞MHC Ⅱ的表达,减少成熟树突状细胞脂质过氧化水平我们发现sh-Rab27a组肿瘤生长减缓,但是体外划痕、transwell侵袭实验结果显示sh-Rab27a组对其活性、迁移、侵袭实验没有影响。我们随后检测了胶质瘤脑部T细胞和树突状细胞量的变化,发现抑制胶质瘤外泌体分泌能增加了胶质瘤浸润树突状细胞和CD8~+T细胞的数量,我们主要针对树突状细胞进行了研究,检测树突状细胞表面分子MHC Ⅱ、CD80、CD86的表达,发现sh-Rab27a组MHC Ⅱ表达升高,说明抑制胶质瘤外泌体分泌会增加高表达MHC Ⅱ的树突状细胞数量,由于体内高表达MHC Ⅱ的树突状细胞不足以支持本课题后续研究。随后在体外培养成熟树突状细胞并用CMAC染料标记,通过尾静脉注射回输到胶质瘤模型中,我们发现sh-Rab27a组脂质过氧化Liperfluo比Ctrl组水平低。3、胶质瘤外泌体通过PPARγ/NRF2/GPX4途径诱导成熟的树突状细胞发生铁死亡体外细胞实验我们将胶质瘤外泌体分别加入成熟(高表达MHC Ⅱ)和未成熟(低表达MHC Ⅱ)树突状细胞进行检测,结果显示胶质瘤外泌体能减弱两种状态树突状细胞活力,然而LDH实验结果显示成熟树突状细胞细immediate consultation胞膜破坏更严重,同时也能抑制成熟树突状细胞IL-12的分泌能力,加入星形胶质细胞外泌体作为对照的实验中发现星形胶质细胞外泌体对成熟的树突状细胞活性没有影响。因此我们选择成熟的树突状细胞进行了后续铁死亡的检测,结果表明胶质瘤来源的外泌体处理成熟树突状细胞可增加Fe~(2+)、脂质过氧化物MDA和Liperfluo、活性氧ROS的含量,降低谷胱甘肽GSH含量,同时透射电镜结果显示线粒体变小膜密度增加,JC-1膜电位检测结果显示线粒体膜电位降低,Western Blot结果显示蛋白PPARγ表达升高,NRF2、SLC7A11、寻找更多GPX4铁死亡抑制蛋白表达下降。以上表明胶质瘤来源的外泌体能够促进树突状细胞脂质积累并且诱导成熟的树突状细胞发生铁死亡。结论胶质瘤来源的外泌体促进脑内浸润的树突状细胞脂质积累,并且通过PPARγ/NRF2/GPX4通路诱导成熟的树突状细胞发生铁死亡。这个发现解释了胶质瘤浸润树突状细胞主要表现为未成熟的原因之一,同时也会为负载肿瘤外泌体的树突状细胞疫苗治疗胶质瘤提供新思路,提示我们采用树突状细胞疫苗治疗胶质瘤过程中,能抑制树突状细胞的铁死亡可能会具有更好的疗效。