弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生虫,几乎感染所有温血动物,可通过人、畜、禽等多种动物进行传播,严重危害公共卫生安全和畜牧业发展。当前临床上治疗该疾病主要以药物治疗为主,但药物治疗存在疗程长、毒副作用大、对慢性弓形虫病无效等缺陷,现有药物的长期使用导致耐药性产生,因此急需寻找新的防控弓形虫病的药物。本研究对甲苯黄丁脲、咖啡因、蒿甲醚、黄芪甲苷、双氢青蒿素、甘草次酸、右美沙芬、黄芩素和酮洛芬这9种具有潜在抗弓形虫作用的化合物进行抗弓形虫效果的筛选和评价,并对有抑虫作用的药物进行机制探究,最后用小鼠评价药物对急性弓形虫感染的控制效果。首先采用MTT法,在人包皮成纤维细胞(HFF)上测定9种药物的细胞毒性,接着在药物安全浓度下,通过噬斑实验初步评估药物体外抗弓形虫效果。对筛选出的抗弓形虫药物,通过双色免疫荧光法评价药物对弓形虫入侵效率的影响;通过分析RH速殖子在HFF细胞中形成的纳虫泡(PV)的数量及每个纳虫泡中速殖子的个数来评估药物对弓形虫胞内增殖的影响。接着进一步探究药物抗弓形虫的潜在作用机制,采用JC-1线粒体膜电位检测方法,检验药物处理速殖子后的线粒体膜电位变化;通过活性氧(ROS)检测,分析速殖子在药物连续处理3 h后产生ROS的情况,通过荧光定量PCR测定药物对弓形虫过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD1)、过氧化物酶(Prx2)基因表达的影响,最后选取甘草次酸,评价其对急性弓形虫感染的小鼠体重、腹水荷虫量以及存活率的影响,综合评估其对急性弓形虫病的治疗效果。细胞毒性结果表明:甲苯黄丁脲、黄芪甲苷、咖啡因和黄芩素在很小浓度下就对HFF细胞产生较强的毒性,因此不宜进一步研究。其余5种药物的半数细胞毒性浓度(CC50)分别为:蒿甲醚866.4μM、双氢青蒿素565.7μM、甘草次酸351.2 μM、右美沙芬123.8 μM、酮洛芬106 μM。在药物安全浓度范围内开展了噬斑MCC950溶解度实验,结果表明:与未处理组相比,5种药物处理组中弓形虫感染HFF细胞后形成的噬斑面积均较小、数量均有不同程度的减少,说明药物有良好的抗弓形虫作用。进一步评价了蒿甲醚、双氢青蒿素、甘草次酸、右美沙芬和酮洛芬的半数抑虫浓度(IC50),结果显示5种药物的 IC50 分别为:9.035 μM、10.03μM、28.0Barasertib2μM、24.4 μM 和 43.01 μM。接着探究了药物抑制弓形虫增殖的作用阶段,首先弓形虫入侵细胞的研究结果表明:蒿甲醚和双氢青蒿素分别在作用40 min和20 min这两个时间点,均对速殖子入侵HFF细胞有一定的抑制作用(P<0.05),而甘草次酸、右美沙芬和酮洛芬3种药在作用20min、40min和60min,均不影响速殖子入侵细胞的能力。接下来评价了蒿甲醚、双氢青蒿素、甘草次酸、右美沙芬和酮洛芬这5种药物对弓形虫胞内增殖效率的影响,结果显示:除酮洛芬外,其余4种药物处理弓形虫感染的HFF细胞24 h后,PV中速殖子个数大多在16个及以下。与对照组相比,4种药物在48h均能抑制速殖子胞内增殖。接着进一步探究药物潜在的抗弓形虫作用机制,检测了弓形虫线粒体膜电位JC-1单体与多聚体的比值和ROS释放Medical care情况,结果发现蒿甲醚、双氢青蒿素、甘草次酸和右美沙芬这4种药物均可不同程度破坏弓形虫线粒体膜电位,在3h内持续产生较高的ROS。进一步通过qPCR检测了弓形虫3种抗氧化基因(SOD1、CAT和Prx2),结果发现:与对照组相比4种药物均能导致弓形虫SOD1、CAT和Prx2的表达先显著升高,随后逐渐下降。甘草次酸体内实验结果表明:实验组具有一定的抗弓形虫效果,但作用相比磺胺嘧啶对照组仍有较大差距,与感染未治疗组相比,体重变化差异不明显,腹水荷虫量在第7天稍有差异,甘草次酸剂量为150mg/kg时,小鼠存活时间可延长2d。综上所述,本实验筛选出的蒿甲醚、双氢青蒿素、甘草次酸和右美沙芬具有低细胞毒性和一定的抗弓形虫效果,能够以抑制弓形虫胞内增殖的方式抑制弓形虫的生长,作用机制可能与破坏弓形虫线粒体膜并产生氧化应激相关。体内治疗急性感染的弓形虫效果不佳,有待进一步优化研究。实验结果表明蒿甲醚等4种药物有作为抗弓形虫药物的潜力。本实验为筛选有效抗弓形虫候选药物提供理论依据。