平菇(Pleurotus ostreatus)是世界范围内广泛栽培的食用菌之一。平菇细菌性黄斑病是生产过程中常见的一种病害,严重影响产量和品质,常造成重大的经济损失。托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)是引起平菇黄斑病的主要病原菌,平菇品种对托拉斯假单胞杆菌的抗性差异较大,本课题在评价平菇品种黄斑病抗性的基础上,选择两个抗性差异品种,研究平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制,及品种间抗性差异的原因,主要结果如下:1.将托拉斯假单胞杆菌接种32个平菇品种,于接种后24 h统计病情指数,发现华平36、平8129、特抗650、平早秋615抗病性最好,而黑美89、夏灰1号、华平801品种抗性最差。2.选择抗性差异最大的两个品种(华平801和华平36),将其子实体接种托拉斯假单胞杆菌后,于接种12 h、24 h和72 h后观察症状。发现敏感品种华平801接种12 h后菌盖便出现轻微黄化,24 h表现为大面积黄褐色斑,72 h子实体严重萎缩,呈现水渍状,菌盖全部黄化;而华平36品种在接种病原细菌12 h和24 h后均无症状,接种72 h后菌盖出现少数不扩展的黄色斑点。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜,观察将各时间点患病和健康子实体样本的超微结构。发现两品种菌丝形态和细胞形态差异很大,感病品种接种表面分布大量细菌,菌丝基本全部被细菌包埋,出现断裂和孔洞,而抗病品种细菌分布非常少;感病品种细胞严重变形,产生大量囊泡,细胞内容物外泄,线粒体也发生变形,而抗病品种没有这些细胞变化或轻度发生。3.对各时间点患病及健康样本进行了酶活性测定,结果发现接种托拉斯假单胞杆菌后平菇子实体酪氨酸酶活性、超氧化物歧化酶活性、细胞内丙二醛含量产生变化。抗病品种的酪氨酸酶活性和细胞内丙二醛含量显著低于敏感品种,超氧化物歧化酶活性显著高于敏感品种,表明感病品种酪氨酸酶被激活,细胞受损伤程度大,清除活性氧能力弱。4.对两个品种各时间点患病及健康样本进行了转录组测序,Gene OntCX-5461配制ology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析结果说明,对于敏感品种华平801,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在氧化磷酸化、线粒体跨膜转运、活性氧、奥斯丁醇代谢等生物过程;接种24 h后的差异表达基因主要富集在甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、羧酸代谢、氧化还原酶活性等过程;72 h的差异表达基因主要富集在单氧酶活性、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢过程;而抗性品种华平36,接种病原菌12 h的差异表达基因主要富集在芳基醇脱氢酶活性、青霉素和头孢菌素生物合成等生物过程;接种24 h后的差异表达基因未富集到显著的生物过程;72 h的差异表达基因主要富集在甲苯降解、甲酸代谢等途径。时间序列分析结果表明,华平801品种不同表达模式的基因聚类到8个模块,华平36品种不同表达模式的基因聚类到6个模块。5.结合共表达网络分析结果,基于基因功能注释,构建了平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的模型:平菇细胞感受到病原细菌侵染的信号后,通过信号转导途径转导至胞内,编码谷胱甘肽S-转移酶、苯丙氨酸和组氨酸解氨酶、MFS转运蛋白等解毒酶基因被激活,同时细胞色素p450也参与将有毒物质转化或排至细胞外;过氧化物酶基因被激活Cobimetinib以抵抗活性氧的损伤,同时细胞核内进行DNA修复以抵御病原菌的伤害,细胞色素c参与细胞凋亡以维持内环境稳定;膜结构被破坏导致酚类物质被释放,脂肪酸含量升高使细胞膜流动性增大,酪氨酸酶基因被激活,催化酚类物质产生黑色素,造成黄斑症状。6.基于比较转录组信息,分析了平菇品种抗性差异的原因。对照敏感品种,抗病品种中编码真菌毒性、溶菌酶等基因大量上调表达,使细菌不能定殖、增殖;抗病品种细胞受损伤程度小,而感病品种细胞膜受破坏程度大,细胞内容物外泄严重,线粒体受损伤大,细胞不能正常生长;抗病品种酪氨酸酶基因未显著上调表达,酪氨酸酶活性低,无法氧化酚类物质造成黄斑症状;抗病品种SOD酶在接种细菌后一直处于较高水平,可以有效清除活性氧损伤,而感病品种后期SOD酶活性很低。7.于转录组测序结果中挑选出30个候选基因,这些基因在抗性和感病品种间显著差异性表达,并且在其他物种中与抗病性相关,其中包括编码乙醇脱氢酶、溶菌酶、丝氨酸/苏氨酸激酶的基因。测定了这些候选基因在各平菇品种患病子实体中的表达量,与各个品种的病情指数做相关性分析发现,乙醇脱氢酶基因(gene＿6990)、鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)的相对表达量与病情指数间呈显著正相关性;细菌α-l-鼠李糖苷酶发夹结构域基因(gene＿4782)、溶菌酶基因(gene＿6008)、乙醇脱氢酶基因(gene＿5811)相对表达量与病情指数呈显著负相关性。在华平36和华平801品种中克隆了具有相关性的候选基因,发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(gene＿5188)和鞘磷脂磷酸二酯酶基因(gene＿2176)在两品种间有大量单核苷酸多态性和插入/缺失位点,后续可用于筛选快速鉴定平菇品种抗性的分子标记。本课题对平菇群体进行了抗病性鉴定,筛选出了黄斑病抗性平菇品种,挖掘了部分抗病相关基因,对平菇响应托拉斯假单胞杆菌侵染的机制及平菇品种抗性差异的原因进行了研究,有助于深入研究食用菌细菌性黄斑病的发生机制,为平菇的抗性育种和食用菌细菌性黄斑surrogate medical decision maker病的高效防治提供了参考依据。