猪流Q-VD-Oph临床试验行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科Alphacoronavirus病毒属。PEDV主要感染猪小肠上皮细胞,引起新生仔猪的急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率,给养猪业造成了巨大的损失。近年来,由于PEDV变异株的出现,除了少数几种疫苗外,缺乏有效的治疗方法来抑制PEDV的感染和传播。因此,寻找有效的药物控制PEDV感染具有重要意义。咔唑生物碱是一类含氮芳香杂环化合物天然物质,主要分布于煤焦油和芸香科植物中。咔唑生物碱及selleck VP-16其衍生物具有显着的抗菌、抗原生动物、杀虫、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗病毒和神经保护活性等各种生物学特性并且已被证明部分具有抗人类病原体的作用,但其是否具有抗PEDV等冠状病毒的活性仍不清楚。本研究通过体外实验筛选并探究了咔唑生物碱衍生物对PEDV复制的抑制作用和作用机制,结果和内容如下:本研究首先通过荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和荧光显微镜评估了Vero-81细胞在18种咔唑衍生物(分别编号为No.1-No.18)处理之后感染PEDV,其N基因拷贝数和感染PEDV荧光毒株细胞中荧光情况,筛选出No.5、No.7、No.18 3种咔唑生物碱衍生物在体外有抗PEDV活性。并通过流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测Vero-81细胞分别在处理No.5、No.7、No.18之后,感染PEDV荧光毒株24 h荧光值,发现细胞中荧光值显著降低,说明No.5、No.7、No.18在体外具有高效的抗PEDV感染效果。其中有No.7、No.18两种咔唑衍生物经过细胞毒性实验验证对Vero-81细胞的毒性小于80%。在此实验基础上对这两gamma-alumina intermediate layers种咔唑衍生物的抗PEDV活性进行探究,通过免疫印迹(Western Blot,WB)、荧光定量PCR和组织半数感染量(tissue culture infective dose,TCID_(50))分别在PEDV N蛋白水平、N蛋白mRNA水平、病毒滴度几个方面探究咔唑衍生物不同浓度的抗PEDV效果,发现其存在剂量依赖性。进一步探究了咔唑衍生物对PEDV感染复制周期的影响,结果表明在PEDV感染周期的吸附阶段加入咔唑衍生物,N基因拷贝数和病毒滴度较对照显著降低。同时为了探究咔唑衍生物对猪肠道冠状病毒的广谱抑制作用,将猪δ冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)和PEDV、猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)分别感染经No.7、No.18处理后的LLC-PK1细胞和Vero-81细胞,发现PDCoV N蛋白mRNA水平、PEDV N蛋白mRNA水平、SADS-CoV M蛋白mRNA水平和病毒滴度皆较对照显著降低,说明本研究筛选的两种咔唑衍生物对猪肠道冠状病毒有广谱抑制作用,本研究不仅为开发抗PEDV药物奠定了基础,更为研究广谱抗猪肠道冠状病毒药物提供了新的思路。