目的:1.通过微量稀释法测定不同浓度有机溶剂对光滑念珠菌生长的影响,筛选后续实验药物的助溶剂。2.通过微量稀释法测定根皮素对光滑念珠菌的最低抑菌浓度。3.通过颊黏膜上皮细胞黏附实验及生物膜实验探讨根皮素对光滑念珠菌毒力因子的影响。方法:1.不同浓度常见有机溶剂对光滑念珠菌生长的影响根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的CLSI M27-Stroke geneticsA3采用微量稀释法结合吸光度值(用OD_(600)表示)分别探讨有机溶剂二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)、丙酮、甲醇和乙醇在48h培养周期内对光滑念珠菌生长的抑制作用,筛选后续实验的药物助溶剂。2.根皮素对光滑念珠菌的体外药物敏感性试验根据CLSI M27-A3标准,采用微量稀释法结合吸光度值(用OD_(600)表示)测定根皮素对光滑念珠菌的最低抑菌浓度(the Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。3.根皮素对光滑念珠菌毒力因子影响的研究3.1颊黏膜上皮细胞黏附实验将等体积(0.5m L)的颊黏膜上皮细胞(Buccal Epithelial Cells,BECs)(1×10~5cell/m L)分别与含0.64mg/m L(最低抑菌浓度组)、0.32mg/m L(亚抑菌浓度组)根皮素的光滑念珠菌液(1×10~6cell/m L)于试管中混匀,并设置不含根皮素的对照组,37℃水浴振荡培养1.5h,12μm聚碳酸酯膜过滤,50m L PBS洗涤,将滤膜载有细胞一面置于载玻片上,自然干燥,固定,行革兰氏染色后显微镜下计数黏附于50个BECs上的念珠菌细胞的数量,用H值表示,探讨根皮素对光滑念珠菌黏附颊黏膜上皮细胞能力的影响。3.2生物膜实验3.2.1 MTT法研究光滑念珠菌生物膜生长动力学取100μL浓度为1×10~6cell/m L光滑念珠菌菌悬液于96孔板,37℃培养1.5h、12h、24h、48h、72h,轻轻吸除各时间点96孔培养板中的培养液,PBS洗涤2次后使用MTT法测定光滑念珠菌生物膜的生长活性并绘制生长动力学曲线。3.2.2根皮素对光滑念珠菌生物膜形成的影响将等量(500μL/50μL)的根皮素稀释液0.64mg/m L(最低抑菌浓度组)、0.32mg/m L(亚抑菌浓度组)与等量(500μL/50μL)2×10~6cell/m L菌液于6孔培养板/96孔培养板混合,对照组为等量(500μL/50μL)RPMI 1640液体培养基与等量(500μL/50μL)2×10~6cell/m L菌液(不含根皮素),37℃培养1.5h、24h、48h。3.2.2.1倒置显微镜下观察生物膜形态。各时间点吸去培养液,1000μL PBS洗涤2次后加入500μL甲醇固定15min,倒置显微镜下观察并拍照。3.2.2.2 MTT法检测根皮素对光滑念珠菌生物膜生长活性的影响。各时间点吸去培养液,100μLPBS洗涤2次后加入MTT工作液20μL/孔,37℃避光孵育4h,弃去上清液,加入DMSO 100u L/孔,37℃孵育30min,测定OD_(490)值。结果:1.不同浓度常见有机溶剂对光滑念珠菌生长活性的影响微量稀释法结合吸光度值(OD_(600)值)考察DMSO、丙酮、甲醇和乙醇4种常见有机溶剂对光滑念珠菌生长活性的影响,发现随着浓度增高,4种常见有机溶剂作用下的光滑念珠菌的OD_(600)值逐渐减小,其中,2.5%以上(含2.5%)DMSO/丙酮作用后OD_(600)值均低于生长对照孔(P<0.05),而甲醇和乙醇对光滑念珠菌的生长影响相对较小,仅5%以上(含5%)甲醇/乙醇作用后OD_(600)值显著低于生长对照孔(P<0.01购买FG-4592)。当DMSO、丙酮和乙醇浓度为10%时,生长抑制率分别达到100%、67.53%和30.9%;5%DMSO和5%乙醇对光滑念珠菌生长抑制率分别为24.93%和16.40%,而DMSO和乙醇浓度低于2.5%(含2.5%)、丙酮浓度低于5%(含5%)、甲醇浓度低于10%(含10%)时,生长抑制率均低于10%。2.根皮素对光滑念珠菌体外药物敏感性试验微量稀释法检测根皮素对光滑念珠菌的MIC,肉眼观察发现随着根皮素浓度升高,96孔板中光滑念珠菌的菌落数量逐渐减少,其中0.32mg/m L孔减少最明显。定量分析后发现,与生长对照孔相比,0.08、0.16、0.32mg/m L根皮素与光滑念珠菌共同孵育48h后,OD_(600)值均降低(P<0.05,其中0.16和0.32mg/m L孔P<0.01),根皮素对光滑念珠菌MIC为0.32mg/m L。3.根皮素对光滑念珠菌毒力因子影响的研究3.1颊黏膜上皮细胞黏附实验显微镜下计数50个BECs上黏附的光滑念珠菌数量,发现亚抑菌浓度组(P<0.05)及最低抑菌浓度组(P<0.01)BECs上黏附的光滑念珠菌数量较对照组均减少。3.2生物膜实验点击此处3.2.1 MTT法研究光滑念珠菌生物膜生长动力学随着培养时间的延长,96孔培养板中溶液颜色逐渐变深,OD值也迅速升高,48h时OD值达到高峰,此后逐渐减小,说明48h时生物膜中光滑念珠菌活菌数最多,菌细胞生长最活跃,生物膜趋于成熟。3.2.2根皮素对光滑念珠菌生物膜形成的影响3.2.2.1倒置显微镜下观察生物膜形态孵育1.5h后,对照组可见部分孢子聚集成团,用药两组可见均匀分布的类圆形孢子;孵育24h后,对照组可见大量排列紧密的类圆形孢子,而用药两组孢子数量均减少,亚抑菌浓度组孢子互相聚集成团片状,最抑菌浓度组团片分布较亚抑菌浓度组松散;孵育48h后,对照组和亚抑菌浓度组孢子均匀密集的排列在板底,呈多层膜状结构,而最低抑菌浓度组可见排列密集的孢子相互聚集,呈较大的团片状分布,其间可见少量散在芽生孢子。3.2.2.2 MTT法检测根皮素对光滑念珠菌生物膜生长活性的影响用药两组生物膜生长活性较对照组均降低,且降低程度与孵育时间及药物浓度相关。统计学分析发现,无论是1.5h、24h还是48h,亚抑菌浓度组生物膜生长活性与对照组相比均无统计学意义(P>0.05),而最低抑菌浓度组生物膜生长活性均显著降低(P<0.01)。孵育时间为1.5h和24h时,亚抑菌浓度组分别抑制10.34%和15.89%生物膜形成,最低抑菌浓度组分别抑制44.82%和47.02%生物膜形成,而当孵育时间为48h时,亚抑菌浓度组和最低抑菌浓度组对生物膜的抑制率均下降,分别为1.06%和26.8%。结论:1.DMSO、丙酮、甲醇及乙醇均可抑制光滑念珠菌的生长,且抑制作用随溶剂浓度升高而增强;微量肉汤稀释法检测光滑念珠菌药物敏感性试验中DMSO、丙酮、甲醇和乙醇的添加剂量应低于2.5%、2.5%、5%、5%。2.根皮素能够抑制光滑念珠菌的生长活性;根皮素对光滑念珠菌的MIC为0.32mg/m L。3.根皮素可通过抑制光滑念珠菌的黏附性和生物膜形成抑制光滑念珠菌的毒力因子。