D-塔格糖作为一种新型功能性代糖,因具有特殊生理功能而被广泛用于食品、药品和化妆品等领域。随着近年来市场需求量的增加,生物酶法合成D-塔格糖因具备清洁、低碳和催化特异性强等优势,逐渐成为研究的热点。以乳糖为底物,利用β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶复配制备D-塔格糖具有原料成本低,副产物少的独特优势成为目前工业生产的主要方法。其中L-阿拉伯糖异构酶的催化性能是决定D-塔格糖产量的关键要素。本研究将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum CGMCC2921)来源的L-阿拉伯糖异构酶LfAI在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WS9中进行重组表达,测定其酶学性质并初步探究其催化生产D-塔格糖的能力IDN-6556分子量。后续通过理性设计与叠加突变最终获得优势突变体。根据优势突变体在摇瓶发酵条件的优化结果,进行了3-L罐的高密度发酵,最终实现L-阿拉伯糖异构酶的高效表达。本论文主要研究结果如下:(1)LfAI在B.subtilis中的重组表达及制备D-塔格糖性能表征。将L.fermentum CGMCC2921来源的LfAI在表达宿主B.subtilis WS9中重组表达,摇瓶发酵的酶活为5.71U·m L~(-1);Killer immunoglobulin-like receptor其最适温度为70℃,65℃下半衰期为2 h,60℃下Barasertib作用半衰期为7 h,55℃下半衰期能延长至10 h;最适p H为6.5,在p H 5.0-8.0范围内,4℃下孵育24 h还能维持80%以上的活性,具备较好的稳定性;对其制备D-塔格糖的性能进行表征,以400 g·L~(-1)乳糖为底物,在55℃、p H 6.0、1.0 mmol·L~(-1)Mn~(2+)、1.0 mmol·L~(-1) Co~(2+)、加酶量1.4 mg·m L~(-1)的条件下,反应60 h可获得最高转化率19.91%。(2)对LfAI进行理性设计提高D-塔格糖的转化率。通过序列比对和底物对接模型结构分析,针对L-阿拉伯糖异构酶LfAI对D-半乳糖亲和力,选取围绕底物结合口袋中D-半乳糖C6附近的7个氨基酸残基,构建20个突变体并重组表达,初步筛选获得了7个转化率提高的优势单点突变体;然后将它们进行叠加组合突变,最终获得最优叠加突变Y19E/F279I;后续对其D-塔格糖的制备条件进行了优化,在55℃,p H 6.0,Mn~(2+)与Co~(2+)浓度均为0.25 mmol·L~(-1),500 g·L~(-1)乳糖浓度,加酶量1.0 mg·m L~(-1)条件下获得最高转化率为23.01%。(3)优势突变体Y19E/F279I的摇瓶发酵优化和3-L罐高密度发酵。摇瓶发酵分别从碳源种类及浓度、氮源种类及浓度和复合氮源浓度配比5个方面进行了优化,优化后的摇瓶发酵的总酶活为8.06 U·m L~(-1),是TB培养基发酵的1.36倍。随后,在3-L生物反应器中进行了不同温度的高密度发酵,最终在30℃发酵条件下获得最高总酶活为95.83U·m L~(-1),其目的蛋白浓度为8.33 g·L~(-1),是摇瓶发酵的11.89倍。